60Co γ 射线辐照对苦草种子萌发及生长的影响

邵传龙 陈洪国 龚旭昇,

1（湖北科技学院核技术与化学生物学院 咸宁 437100）

2（湖北省香花植物工程技术中心 咸宁 437100）

沉水植物作为水体的主要初级生产者之一，在维持水生态系统的结构和功能中起着重要作用［1］。沉水植物作为大型草本植物，能够提供更多的空间生态位和改善水体溶氧环境，直接为水生动物提供食物与栖息地，是水生态系统的关键群体。随着对水生态修复的深入研究，水生植物的重要性愈发显著，水生态修复的关键一步，就是看沉水植能否被恢复重建。苦草，拉丁学名：Vallisneria natans(Lour.)Hara，又称蓼萍草，水鳖科苦草属植物，为多年生无茎沉水草本，常生长于溪流、池塘、河渠等地，在中国多个省份广泛分布，且苦草还具有净化水质的作用，可吸收水体中的悬浮物质和磷酸盐，是水生态修复中的重要植物材料［2-3］。

辐射育种技术是利用射线诱导生物的遗传物质发生改变，再经过人工定向选择来培育出新的优良品种的技术方法。利用X射线、γ射线和中子等诱导变异的方法在种子植物中受到了广泛的应用［4］。其中，γ射线具有节能、高变异率、穿透性强和易控制等特点，易于使植物在分子、细胞和个体水平上发生变异［5］。许多研究发现，经过辐照后的植株与自然生长植株的枝条长度和干重差异显著［6］。葛维亚等［7］的研究结果表明，当60Co γ射线的吸收剂量在30 Gy以上时能显著降低地被菊种子的发芽率，并且提高幼苗丙二醛（MDA）的含量和过氧化物酶（POD）的活性。还有研究者发现，烟草种子在进行辐照处理后，30 Gy以上的剂量处理可以显著影响烟叶的光合色素含量，从而抑制烟叶的光合作用［8］。也有实验表明，在低剂量（30 Gy 或60 Gy）辐照处理时，毛竹叶片的叶绿素含量均较高，而在高剂量（120 Gy）辐照处理时叶绿素含量最低［9］。然而，这些研究主要集中在陆生植物上，对水生植物辐照育种的研究极其缺乏，仅看到利用离子束辐射对水雍菜进行育种的研究［10］。

随着苦草的应用越来越广泛，选育具有优良性状的苦草品种具有巨大的实践价值。以前的研究者有利用栽培选择优良性状的方法来选育苦草［11］，但是利用辐照选育苦草品种的方法尚未见报道。本研究通过不同剂量的60Co γ射线处理苦草种子，探讨辐照对其种子萌发和植株生长的影响，以期为选育优良的苦草品种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

苦草种子取自湖北省荆州市长湖。苦草种子经人工除杂和自然风干，再保存于阴凉干燥的环境中。

1.2 方法

1.2.160Co γ射线辐照

2021年3月，将分装后的苦草种子在湖北省农科院农产品加工与核农技术研究所进行辐照处理，在辐照前利用标准剂量体系对辐照位置的吸收剂量率进行校准，校准后该位置吸收剂量率为100 Gy/h，然后以替代法在同一位置辐照苦草种子，通过校准得到的吸收剂量率确定辐照合适的时间，使苦草种子吸收到的剂量值分别为0 Gy、30 Gy、60 Gy和120 Gy，每组吸收剂量重复3次。

1.2.2 种子萌发实验

萌发实验在湖北科技学院室内实验室进行。经过辐照的种子首先用0.5%的高锰酸钾溶液进行消毒处理。种子萌发在培养皿中进行，将种子放入铺上两层滤纸的培养皿，加入10 mL蒸馏水，盖上培养皿，用封口膜封好，在自然条件下进行萌发实验。每隔2 d 补充一次蒸馏水，萌发时间为14 d。每个吸收剂量设置3个培养皿，每个培养皿中放置50 粒苦草种子。发芽率（%）计数见式（1）。

1.2.3 生长实验

生长实验在湖北科技学院温室实验棚进行。将经过3 个不同吸收剂量的苦草种子各取3 g 播入底层有20 cm厚洗净的黄沙的白色塑料桶中，水深设置为50 cm，每组吸收剂量设置3 个重复。45 d后在每个桶中取10 株长势良好的苦草植株进行株高、叶片鲜重、叶绿素a、b 及总叶绿素含量、MDA 含量、超氧化物歧化酶（SOD）、POD 和过氧化氢酶（CAT）活性的测定。株高用直尺测量，鲜重用千分之一电子天平测量，计算出平均值。

1.2.4 生理生化指标的测定

叶片叶绿素a、b 及总叶绿素含量采用乙醇溶液的方法测定；MDA 含量采用硫代巴比妥酸法测定；SOD 活性采用氮蓝四唑法；POD 活性采用愈创木酚氧化法；CAT活性采用紫外吸收法测定［12］。不同剂量下每项指标进行3次重复。

1.2.5 数据处理

利用SPSS 19.0和R 3.5.3进行数据统计和方差分析。计算苦草种子发芽率的均值，和苦草幼苗株高、叶片鲜重、叶片叶绿素a、b 及总叶绿素含量、叶片MDA含量、SOD、POD及CAT活性的均值和标准差，并且比较各处理间的差异显著性（LSD法，p＜0.05）。

2 结果与讨论

2.1 辐照对种子萌发的影响

反映辐照对种子造成损伤程度的重要指标之一是发芽率。有研究表明，低剂量的60Co γ射线辐照会提高种子的发芽率，而高剂量的辐照会严重影响种子的萌发甚至致死［13-14］。由表1可知，不同吸收剂量处理间的苦草种子萌发情况存在较大差异。

表1 不同吸收剂量处理对种子萌发的影响Table 1 Effects of different absorbed doses on V.natans germination

萌发初始，吸收剂量的增加对种子发芽率无显著影响，随着萌发过程的进行，吸收剂量的增加对发芽率具有显著性影响（p＜0.05）。30 Gy 辐照条件下的种子发芽率与对照组无显著差异，第14 天60 Gy 和120 Gy 处理组的苦草种子发芽率要显著低于对照组，这与常媚瑕等［15］对朝天椒种子的研究结果一致，说明一定的辐照处理可使种子细胞内部结构受到不同程度损害，影响到种子的初始萌动过程的酶活性和营养物质的转化，阻碍了种子的萌发进程。

2.2 辐照对苦草生长的影响

从表2 可以看出，0 Gy、30 Gy、60 Gy 和120 Gy 处理的幼苗株高平均值分别为12.25 cm、10.79 cm、10.22 cm 和7.09 cm。其中120 Gy 处理的苦草株高要显著低于对照组（p＜0.05）。120 Gy吸收剂量的苦草长势较差，叶片短小，植株明显出现了矮化现象（图1）。

图1 不同吸收剂量对苦草生长的影响Fig.1 Effects of different absorbed doses on V.natans growth

表2 不同吸收剂量对苦草生长指标的影响Table 2 Effects of different absorbed doses on V.natans growth indexes

同样，0 Gy、30 cm、60 cm 和120 Gy 辐射处理下苦草鲜重平均值分别为0.038 g、0.031 g、0.029 g和0.010 g。30 Gy和60 Gy处理下的苦草鲜重与对照组之间无显著差异，而120 Gy 处理的苦草鲜重显著低于对照组（p＜0.05）。有研究表明，植物种子经过高剂量辐照后萌发生长的植株会出现明显矮化现象［16］。在本实验中，经过辐照处理的苦草株高和鲜重都随着吸收剂量的增加而下降，这与常玉龙［17］对二球悬铃木的研究结果一致。较高的吸收剂量对苦草的株高、鲜重的抑制作用较强，可能是种子受到高剂量辐照后其内部组织受到损伤［18-19］，某些植物激素和酶的合成受到抑制，阻碍了细胞分裂、分化和代谢，从而影响了幼苗的生长。

2.3 辐照对苦草生理生化指标的影响

2.3.1 辐照对叶绿素含量的影响

叶绿素含量能够影响植物的光合作用强度。钟楚等［20］认为，受到辐照时，光氧化作用加剧，叶片内氧自由基含量上升，导致叶绿素含量出现下降趋势。如表3 所示，0 Gy、30 Gy、60 Gy 和120 Gy 剂量辐照处理后的苦草叶片叶绿素a、b 及总叶绿素含量之间均出现显著差异，30 Gy组的叶绿素含量显著高于对照组和其他处理组（p＜0.05）。随着吸收剂量的增加，苦草叶片的叶绿素a、b 以及总叶绿素含量均出现先升高后下降趋势，这说明了较低的吸收剂量能提高苦草叶片的叶绿素含量，这与之前的研究结果［21-22］基本一致。推测其可能是由于苦草叶片能适应低剂量辐照，少量氧自由基的出现促进了叶绿素的合成或抑制了其分解过程。

表3 不同吸收剂量对苦草叶绿素含量的影响Table 3 Effects of different absorbed doses on chlorophyll content in V.natans

2.3.2 辐照对丙二醛含量的影响

由图2 可知，4 个吸收剂量下的MDA 含量依次为0.004 nmol/g、0.004 nmol/g、0.007 nmol/g 和0.009 nmol/g，0 Gy、30 Gy和60 Gy剂量处理组之间的苦草叶片MDA含量无显著差异。120 Gy辐射处理下的苦草叶片MDA 含量要显著高于对照组（p＜0.05）。先前的研究表明，MDA 的含量反映了细胞膜脂质损伤的程度，膜脂过氧化程度越高，MDA 含量越高，细胞中各种酶和膜系统受到的损伤就越严重［23］。随着吸收剂量的增加，苦草叶片中MDA的含量呈现升高的趋势，说明苦草叶片中的细胞发生膜脂过氧化，细胞膜功能发生紊乱，其在辐照下表现出明显的生理损伤特征。

图2 不同吸收剂量对苦草丙二醛含量的影响Fig.2 Effects of different absorbed doses on the content of malondialdehyde in V.natans

2.3.3 对抗氧化酶活性的影响

当植物受到辐照胁迫时，细胞内活性氧（ROS）自由基的含量会增加，导致细胞结构破坏，功能紊乱，代谢异常，从而影响植物的正常生长。植物体内的SOD、POD 以及CAT 等抗氧化酶类可以有效清除植物体内的活性氧自由基，这些酶的活性能反映植物体的抗逆能力［24］。

从图3 可知，0 Gy、30 Gy、60 Gy 和120 Gy剂量处理下的苦草叶片SOD活性分别为571.99 U/g、832.05 U/g、1 071.76 U/g和1 009.37 U/g，60 Gy和120 Gy 处理组的苦草叶片SOD 活性显著高于对照组（p＜0.05）。SOD 活性的上升是苦草对辐射胁迫的自我保护现象［25］，因为SOD 合成及降解途径相关酶活性发生变化导致了SOD 的大量积累，免于活性氧对细胞DNA 和蛋白质结构的损伤。而苦草叶片POD活性在0 Gy、30 Gy、60 Gy和120 Gy处理中分别为7 465.87 U/g、5 334 U/g、4 842.47 U/g和4 471.85 U/g，方差分析结果显示各剂量处理之间苦草叶片POD活性无显著性差异（图4）。

图3 不同吸收剂量对苦草SOD活性的影响Fig.3 Effects of different absorbed doses on the activity of SOD in V.natans

图4 不同吸收剂量对苦草POD活性的影响Fig.4 Effects of different absorbed doses on the activity of POD in V.natans

如图5 所示，对照组的苦草叶片CAT 活性最高，为1 339.33 U/g，120 Gy 剂量处理下的活性最低，为32.46 U/g，30 Gy、60 Gy 和120 Gy 剂量处理的苦草叶片CAT 活性均显著低于对照组（p＜0.05），但这3 个剂量处理组之间的苦草叶片CAT活性无显著性差异。这是由于CAT 代谢系统对辐射较敏感，经辐照后苦草叶片中活性氧自由基大量积累，CAT 失去了防御和修复的能力，酶活性逐步下降。

图5 不同吸收剂量对苦草CAT活性的影响Fig.5 Effects of different absorbed doses on the activity of CAT in V.natans

综上所述，苦草种子在经过不同吸收剂量辐照处理后，其叶片SOD 与CAT 活性变化显著，而POD 对辐照处理不太敏感，说明了苦草叶片中的主要保护酶为SOD 与CAT，它们的活性变化可以作为判定苦草对辐照敏感性和损伤变异的生理指标。

3 结论

60Co γ 射线辐照对苦草种子萌发和生长影响较大。随着吸收剂量的增加，苦草种子的发芽率、苦草的株高及鲜重均显著下降。辐照后的苦草叶片叶绿素a、b 以及总叶绿素含量出现先升高后下降趋势。随着吸收剂量的增加，CAT 活性显著低于对照组，而叶片的SOD 活性显著高于对照组，120 Gy剂量处理的苦草叶片MDA含量也要显著高于对照组。因此，苦草可利用60Co γ射线进行辐射诱变，为今后苦草的新品种选育提供一定参考。