天花粉中瓜氨酸含量的荧光检测

陈汇鸿，向玲玲，梁韵诗，伍海婷，黄新安，张静（广州中医药大学青蒿研究中心，广州 510405）

天花粉（Trichosanthis Radix）为葫芦科植物栝楼的干燥根，是一种常用的中药。其性味甘、微苦、微寒，具有清热泻火、生津止渴、消肿排脓的作用，常用于治疗热病烦渴、肺热燥咳、疮疡肿毒[1-2]。现代医学研究表明其提取物具有治疗糖尿病、终止妊娠、抗肿瘤、抗病毒等药理作用[3-7]。 瓜氨酸是天花粉的主要特征氨基酸[8]，同时也是《中国药典》规定的天花粉定性鉴别的标准。目前，天花粉中瓜氨酸的定量检测主要有以下3种方法：

① 高效液相色谱法[9-10]：该法通常需要将无紫外吸收的氨基酸进行柱前衍生化，然后采用高效液相色谱对瓜氨酸衍生物进行分离和定量分析。最近也有报道采用蒸发光散射检测器，可以直接测定天花粉配方颗粒中的瓜氨酸含量[11]。② 薄层色谱法[12]：该法通过硅胶薄层色谱将瓜氨酸与其他物质分离，然后采用茚三酮试液显色，通过扫描峰面积而得到瓜氨酸含量。③ 紫外分光光度法[13-14]：该法的原理是瓜氨酸选择性与二乙酰肟在强酸（硫酸＋磷酸）高温下反应生成有紫外吸收的产物，然后通过测定反应混合液的吸光度而得到瓜氨酸含量。这3种方法都能准确测量天花粉中的瓜氨酸含量，可以为天花粉药材的质量评价提供客观依据，但是目前仍难以实现大规模和高通量的检测。

基于荧光技术具有灵敏度高和便捷快速等优势，我们在前期的工作中，设计合成了一类高选择性的瓜氨酸荧光探针Napdialyne[15]。该化合物本身无荧光，但是在酸性条件下可以与瓜氨酸反应生成高荧光的加成产物。本研究拟使用该荧光探针首次探索天花粉中瓜氨酸含量的荧光测定（检测原理见图1），并与其他两种测定方法（紫外分光光度法和薄层色谱法）进行对比，为天花粉中瓜氨酸含量的检测提供新的技术手段。

图1 瓜氨酸荧光探针Napdialyne的检测原理Fig 1 Detection principle of citrulline fluorescent probe Napdialyne

1 材料

1.1 仪器

TU-1900紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；CAMAG TLC Scanner 4薄层色谱扫描仪（瑞士卡玛有限公司）；Thermo Scientific Varioskan LUX酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司）；KQ-50B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ST60-4微孔板恒温振荡器（杭州米欧仪器有限公司）。

1.2 试药

L-瓜氨酸对照品（上海毕得医药科技股份有限公司，纯度＞98%，批号：RNV684）；无水乙醇、二甲基亚砜、二乙酰肟、浓硫酸、磷酸、异丙醇、三氯乙酸、正丁醇、茚三酮、冰醋酸均为分析纯；天花粉药材均购买自广州市面药店，分别是杏园春（河南产地），百姓大药房（四川产地），松草堂旗舰店（安徽产地），经广州中医药大学中药学院药用植物教研室杜勤教授鉴定，并研磨成细粉。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取4.6 mg的L-瓜氨酸对照品溶解在525 μL 50%乙醇中，配制成初始浓度为8.76 mg·mL－1的L-瓜氨酸溶液。

2.2 供试品溶液的制备

精确称取3 g天花粉粉末置于锥形瓶中，加入10 mL 50%乙醇，超声30 min，过滤，用50%乙醇定容至10 mL，待用。

2.3 瓜氨酸含量测定

2.3.1 荧光法 在96孔板中依次加入100 μL纯水、40 μL 100%（w/v）三氯乙酸水溶液、40 μL 50%乙醇、10 μL荧光探针Napdialyne（0.314 mg·mL－1，DMSO溶解）以及10 μL供试品溶液，将其置于50℃下震荡孵育3 h。冷却后，取10 μL反应液于90 μL DMSO溶液中稀释后测量荧光，λex＝320 nm，λem＝376 nm。

2.3.2 紫外分光光度法 取1 mL供试品稀释溶液，依次加入0.25 mL 30 g·L－1二乙酰肟水溶液、1 mL混合酸（V硫酸∶V磷酸＝3∶1），摇匀。置于100℃下，避光煮沸30 min。冷却至室温后，测定490 nm处的吸光度。

2.3.3 薄层色谱法 精密吸取样品并点样在硅胶板上，采用正丁醇-无水乙醇-冰醋酸-水＝8∶2∶5∶3展开，吹干后在硅胶板上喷洒茚三酮显色剂，高温下吹干显色。置于薄层色谱仪中，500 nm下扫描，读取数值。

采用以上3种方法，对河南产地的天花粉中瓜氨酸的含量进行了测定。结果荧光法、紫外分光光度法、薄层色谱法测得的瓜氨酸含量分别为2.083%（RSD＝1.7%）、1.849%（RSD＝2.7%）和1.697%（RSD＝1.2%）。数据吻合较好，这说明荧光法可以较准确地测定天花粉中瓜氨酸的含量。

2.4 线性关系考察

用50%乙醇逐步稀释对照品溶液配制梯度对照品溶液，按“2.3”项下条件进行测定，以瓜氨酸的浓度为横坐标（X），荧光强度/吸光度/吸收峰面积为纵坐标（Y），绘制线性标准曲线，结果在荧光法中，荧光强度与L-瓜氨酸对照品的浓度呈现出良好的线性关系，线性回归方程为Y＝131.0X＋1.173，线性范围为0.0017～0.44 mg·mL－1，线性系数（R2）为0.9962；在紫外分光光度法中，回归方程为Y＝2.733X＋0.016 76，线性范围为0.004～ 0.25 mg·mL－1，R2为0.9951；在薄层色谱法中，回归方程为Y＝1.818×104X－59.22，线性范围为0.024～0.30 mg·mL－1，R2为0.9953。同时，以3倍空白标准偏差除以标准曲线的斜率，估算荧光法的检测限（LOD）为0.39 μg·mL－1。

2.5 精密度考察

精密吸取供试品溶液，按“2.3.1”项下反应条件，连续检测6次，计算得到荧光强度的RSD为0.66%，说明仪器的精密度良好。

2.6 重复性考察

精密称取天花粉粉末适量，按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液。按“2.3.1”项下条件进行测定，记录荧光值，计算得到瓜氨酸含量的RSD值为1.7%，说明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率考察

精密称取供试品溶液5份，分别测定瓜氨酸含量。然后按大约1∶1的比例加入瓜氨酸对照品，按“2.3.1”项下方法进行测定，计算平均加样回收率。结果荧光法的加样回收率在97.09%～ 106.84%，RSD值在1.6%～2.7%，说明该方法的准确度较高。

2.8 不同产地天花粉中瓜氨酸的含量测定

为考察荧光法测定天花粉中瓜氨酸含量的适用范围，分别收集了市面药店所售的河南、四川、安徽3个产地的天花粉，测定其瓜氨酸的平均含量分别为2.083%、1.423%、1.835%（见表1）。其结果存在一定差异，表明本方法可以用于不同产地天花粉中的瓜氨酸的定量检测。

表1 不同产地天花粉的瓜氨酸含量测定 Tab 1 Citrulline content in Trichosanthis Radix from different producing areas

3 讨论

近年来，荧光检测技术由于快速、灵敏、便捷等优点，被广泛应用于各种生物检测中，但是其在中药材鉴定和质量控制方面的研究仍较少。本研究采用课题组前期构建的高选择性瓜氨酸荧光探针Napdialyne，首次系统地建立了一套天花粉中瓜氨酸含量的荧光测定方法。通过与其他两种常见的瓜氨酸测定方法（紫外分光光度法和薄层色谱法）对比，笔者发现3种方法结果较为接近，测得的瓜氨酸含量分别为2.083%、1.849%、1.697%。

虽然目前已有3种方法可以用于检测瓜氨酸含量，但在检测的便利性上三者均存在一定的局限。高效液相色谱法对设备的要求较高，且耗时较长；紫外分光光度法需要高温强酸的反应条件，笔者在前期的条件优化过程中也发现该法需要严格避光和控制时间，否则会出现较大的误差；薄层色谱法则需要先通过硅胶薄层色谱对瓜氨酸进行分离，然后茚三酮高温显色，存在手工操作的差异。此外，受限于苛刻的反应条件或色谱分离步骤，这3种方法均不能用于高通量检测。相比之下，荧光法通常在96孔板中进行，具有简便、可靠、检测通量高、线性范围广等优点，可以为天花粉的质量控制提供新的快速检测手段。

致谢：感谢广州中医药大学中药学院张蕾教授在薄层色谱扫描仪使用上的协助。