益肾强身丸和防衰益寿丸改善小鼠生殖功能研究

黄芷棋，宁一博，贺润铖，孙建宁，董世芬（北京中医药大学中药学院中药药理系，北京 102488）

衰老是随年龄增加，机体各组织、器官缓慢出现、普遍发生的退行性变化过程[1-2]。性功能障碍如睾丸功能退行性病变、生精能力减弱、睾酮水平降低等会随着衰老逐渐出现[3]，主要表现为性欲低下和勃起功能障碍。因此，改善生殖健康成为研究抗衰老的重要问题之一。

益肾强身丸和防衰益寿丸是施今墨先生抗衰老名方，以“药对”形式配合早晚服用，早服益肾强身丸，晚服防衰益寿丸。益肾强身丸，有益肾填精、补气养血之功效，可用于肾精不足、气血两虚、胸闷气短、失眠健忘、腰腿酸软、全身乏力、脑力减退等。防衰益寿丸，有滋阴助阳、培元固本之功效，用于脏腑机能失调、气血阴阳俱损、面色无华、心悸怔仲、神疲乏力、胃寒肢冷、健忘失眠、五心烦热、食欲不振、便溏或便秘、月经不调、小便颇数或夜尿多等。

益肾强身丸和防衰益寿丸临床广泛用于衰老相关疾病的防治以及亚健康状态的早期干预[4]，但是有关其干预生殖功能的作用及机制的深入研究较少。本文考察了益肾强身丸和防衰益寿丸对生殖功能的改善作用。

1 材料

1.1 动物

2月龄雄性SPF级C57BL/6J小鼠48只，体质量（22±3）g [北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SYXK（京）2020-0033]。2月龄雌性SPF级C57BL/6J小鼠48只，体质量（20±3）g [北京维通利华实验动物技术有限公司，SCXK（京）2016-0006]。所有小鼠饲养于北京中医药大学屏障环境动物实验室[SYXK（京）2016-0038]，均通过北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会审批[BUCM-4-2020101601-4159]，室温（25±2）℃、45%相对湿度，12 h/12 h光暗周期，饲养期间小鼠自由进食及饮水。

1.2 试药

益肾强身丸、防衰益寿丸粉末[北京同仁堂天然药物（唐山）有限公司，批号：17030066、16030061]。五子衍宗丸[5]（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号：19035100），其成分为枸杞子、菟丝子（炒）、覆盆子、五味子（蒸）、盐车前子，辅料为赋形剂蜂蜜。苯甲酸雌二醇注射液（江西博莱大药厂有限公司，规格：2 mL/4 mg，批号：200507），将原液用玉米油稀释20倍即0.1 mg·kg－1待用。睾酮酶联免疫试剂盒（批号：20201028）、一氧化氮（NO）测试剂盒（批号：20201105）、环磷酸鸟苷（cGMP）酶联免疫试剂盒（批号：20201015）（北京华英生物技术研究所）。

1.3 仪器

高速冷冻离心机（5810R，德国Eppendorf公司）；酶标仪（Epoch，美国BioTeK仪器公司）；空气浴震荡器（HZQ-C，哈尔滨市东明医疗仪器厂）；组织匀浆机（Bead Ruptor 24，美国OMNI公司）；小动物行为观察记录分析系统（Noldus，荷兰）。

2 方法

2.1 分组与给药

2月龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠48只，随机分为正常组，益肾强身丸＋防衰益寿丸低剂量组（YS 0.25 g·kg－1＋FS 0.25 g·kg－1组）、高剂量组（YS 0.5 g·kg－1＋FS 0.5 g·kg－1组）及五子衍宗丸1 g·kg－1组（简称阳性药组）。按照0.2 mL/10 g容积灌胃给药，低、高剂量组每日灌胃给药2次，早服益肾强身丸，晚服防衰益寿丸；正常组及阳性药组每日灌胃给药1次，正常组给予相应体积的去离子水。连续干预30 d。2月龄SPF级雌性C57BL/6J小鼠48只，随机平分为8笼，每笼6只。待检测雄性小鼠性行为时，称重小鼠并记录体质量。交配前2 d，按照0.1 mL/10 g给药容积皮下注射雌二醇注射液以刺激雌鼠发情，给药量为1 mg·kg－1。

2.2 小鼠性行为（跨骑次数）检测方法

分别于第7、14、21、28日对小鼠进行交配实验。交配前2 d，雌性小鼠每日1 mg·kg－1皮下注射雌二醇注射液刺激雌鼠发情。交配于18：30～23：00进行，观察时保持室内安静，减少灯光照明，调至昏暗，足以观察交配行为即可，并采集交配行为录像。具体操作为：取雄性小鼠1只置于30 cm×50 cm×20 cm的观察盒内，适应5 min后，放入发情雌性小鼠3只，记录20 min内骑跨次数（mount frequency，MF）：观察时间内爬高总次数，有无插入均计数并统计小鼠交配行为的相关数据。

2.3 体质量记录和相关脏器指数计算

30 d给药结束后，禁食12 h，称取小鼠体质量。眼球取血约1 mL，3000 r·min－1离心10 min，分离血清。取血后，解剖取左右侧睾丸、左右侧附睾、提肛肌、包皮腺称重，并计算相关脏器指数。脏器指数（mg·g－1）＝脏器质量（mg）／小鼠体质量（g）。

2.4 精子数目和活性检测[6]

将称量好的小鼠左侧附睾，置于含有1 mL M199培养液的微型离心管中，剪碎附睾于37℃水浴箱中孵育30 min，使精子充分游出来。用70 μm滤膜滤过得上清液，然后用血球计数板提前置于37℃温箱中预热，吸取微型离心管中混悬液10 μL加于血球计数板的计数池中，用100倍电子显微镜数精子数量；用200倍电子显微镜观察精子活力[精子活力＝（Ⅰ＋Ⅱ）／（Ⅰ＋Ⅱ＋Ⅲ＋Ⅳ）×100%和精子活率＝（Ⅰ＋Ⅱ＋Ⅲ）／（Ⅰ＋Ⅱ＋Ⅲ＋Ⅳ）×100%（Ⅰ表示快速、直线地向前运动的精子数目；Ⅱ表示慢速、迟钝地直线或非直线向前运动的精子数目；Ⅲ表示不向前运动的精子数目；Ⅳ表示不活动的精子数目）]；用400倍电子显微镜观察精子畸形率。

2.5 血清睾酮、海绵体组织NO和cGMP水平检测

参照试剂盒说明书步骤检测血清睾酮、海绵体组织NO和cGMP水平。

2.6 统计学处理

采用SPSS 软件进行统计学处理，实验数据以平均值±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），进一步采用LSD法进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 益肾强身丸和防衰益寿丸对小鼠性行为（跨骑次数）的影响

与对照组比较，给药第3周后，阳性药组及低剂量组可明显增加小鼠跨骑次数（P＜0.01），表明益肾强身丸和防衰益寿丸低剂量组可能对小鼠的性行为有提高作用（见图1）。

图1 益肾强肾丸和防衰益寿丸对小鼠性行为的影响（±s）Fig 1 Effect of Yishen Qiangshen pills and Fangshuai Yishou pills on sexual behavior of mice（±s）

3.2 益肾强身丸和防衰益寿丸对小鼠的性器官指数的影响

与对照组比较，阳性药组能明显提高附睾（双侧）指数以及包皮腺指数（P＜0.001，P＜0.05）；低、高剂量组的睾丸（双侧）、附睾（双侧）、提肛肌、包皮腺指数差异均无统计学意义（P＞0.05），表明益肾强身丸和防衰益寿丸对小鼠的性器官无影响（见表1）。

表1 益肾强肾丸和防衰益寿丸对小鼠性器官指数的影响(±s) Tab 1 Effect of Yishen Qiangshen pills and Fangshuai Yishou pills on sex organ index of mice (±s)

表1 益肾强肾丸和防衰益寿丸对小鼠性器官指数的影响(±s) Tab 1 Effect of Yishen Qiangshen pills and Fangshuai Yishou pills on sex organ index of mice (±s)

注：与对照组比较，*P＜0.05，***P＜0.001。Note：Compared with the control group，*P＜0.05，***P＜0.001。

组别 例数 性器官指数/（mg·g－1）睾丸（双侧）附睾（双侧） 提肛肌 包皮腺对照组 9 8.01±1.37 2.90±0.38 2.88±0.31 2.18±0.49低剂量组 11 8.32±0.83 3.07±0.31 2.79±0.39 2.79±0.65高剂量组 10 7.53±1.05 2.98±0.36 2.85±0.34 2.90±0.98阳性药组 10 8.21±0.61 3.45±0.35***3.17±0.54 3.26±1.58*

3.3 益肾强身丸和防衰益寿丸对小鼠精子数目和活性的影响

与对照组比较，阳性药组、低、高剂量组均能明显增加小鼠精子数目、提高精子活率和精子活力（P＜0.01，P＜0.001），并明显降低小鼠精子畸形率（P＜0.05，P＜0.01），表明益肾强身丸和防衰益寿丸能提高小鼠的精子质量（见图2）。

图2 益肾强肾丸和防衰益寿丸对小鼠精子质量的影响（±s）Fig 2 Effect of Yishen Qiangshen pills and Fangshuai Yishou pills on the sperm quality of mice（±s）

3.4 血清睾酮水平检测

与对照组比较，低剂量组具有升高血清睾酮水平的趋势，但差异无统计学意义（见图3）。

图3 益肾强肾丸和防衰益寿丸对小鼠血清睾酮的影响（±s，n＝9～11）Fig 3 Effect of Yishen Qiangshen pills and Fangshuai Yishou pills on the levels of testosterone in the serum（±s，n＝9～11）

3.5 海绵体组织NO和cGMP水平检测

与对照组比较，低剂量组具有升高海绵体组织NO水平的趋势（P＞0.05）；阳性药组及高剂量组海绵体cGMP水平显著升高（P＜0.05，P＜0.001）（见图4）。

图4 益肾强肾丸和防衰益寿丸对小鼠海绵体组织NO及cGMP水平的影响（±s，n＝9～11）Fig 4 Effect of Yishen Qiangshen pills and Fangshuai Yishou pills on the levels of NO and cGMP in cavernous tissue（±s，n＝9～11）

4 讨论

中医认为肾气虚衰是衰老的关键环节之一。施今墨的经典方药——早服益肾强身丸、晚服防衰益寿丸属于古方大剂模式，药味偏多；施老根据衰老、虚损之医理，采用“对药”的方式调和阴阳、补肾益精从而达到延缓衰老之用[4]。随着年龄增长，男性受勃起功能障碍、前列腺增生等疾病的影响，且随着政策的开放及人们观念的开放，较大龄夫妇的生育需求明显增多，即生育年龄有所推延。因此，改善生殖健康成为研究衰老进程的重要问题之一。

小鼠交配实验是性功能的关键评价指标[7]，交配性行为如骑跨、射精等的潜伏期或次数指标呈阳性，即可提示干预药物能够一定程度地提高小鼠性功能[8]。本实验以小鼠20 min内骑跨次数为指标，结果表明，与对照组比较，给药第3周，低剂量组可明显增加小鼠跨骑次数，提高小鼠的性功能。性器官指数可反映生殖器官的发育情况及损害情况[9]，本实验结果显示低、高剂量组对小鼠的性器官指数均无显著性影响，表明给药后不损害小鼠的生殖器官。 中医认为，肾气充沛则精液充足、精子活跃；肾气不足则精液不足、精子活力和数量下降[10]。益肾强身丸＋防衰益寿丸各剂量组均能明显增加小鼠精子数目、提高精子活率和精子活力，并明显降低小鼠精子畸形率，从而提高小鼠的精子质量。

体内90%的睾酮是由睾丸间质细胞分泌，在临床认为，血清性激素如睾酮（testosterone）的水平与睾丸的生精功能密切相关，其可促进精子的成熟释放以及增强男性性渴求与性欲望[11-12]。当性刺激时，副交感神经、非肾上腺素非胆碱能神经末梢和血管内皮细胞在一氧化氮合成酶（nitricoxide synthase，NOS）的作用下，阴茎神经末梢和海绵体内皮细胞的NO合成增加进而激活鸟苷酸环化酶，促使cGMP水平升高，cGMP 使细胞胞质内Ca2＋浓度降低，海绵体平滑肌松弛进而改善性功能[11-12]。高剂量组小鼠的海绵体组织cGMP水平显著升高，其具体调控机制尚需深入研究。

综上，早服益肾强身丸，晚服防衰益寿丸具有明显提高成年小鼠性功能，改善勃起功能的作用，包括明显增加精子数量、精子活动率，减少精子畸形率，显著提高勃起功能相关指标cGMP水平。