轮叶黑藻组培苗生长规律及炼苗研究

李琬腾 刘 杰 李典鹏 吕 喆 万 云 冷 欣,3* 安树青,3

（1 南京大学生命科学学院，江苏 南京 210046；2 安徽建筑大学环境与能源工程学院，安徽 合肥 230000；3 南京大学常熟生态研究院，江苏 苏州 215501）

生态恢复和生态重建是中国湿地恢复的主要策略，人工干预可促进湿地生态系统的保护恢复(安树青等, 2019)。沉水植物作为水生态系统的重要生产者，在修复水体污染中因具有去除水体中营养物质(Kufel et al, 2002; Clarke et al, 2001)、去除沉积物中污染物(Dai et al, 2014)、促进水体氮磷循环(Li et al, 2008)、加速生态系统的修复(朱江等, 2020)等作用而被广泛使用。轮叶黑藻(Hydrilla verticillate)属水鳖科黑藻属，为多年生沉水植物，普遍生长于世界各处水域中，具有极强的耐污性(林连升等, 2005; Srivastava et al, 2016)，同时自身的净化能力又使其成为水生植物恢复过程中的先锋物种(Wei et al, 2004)。轮叶黑藻通过种子或营养繁殖体进行自我繁殖，且以断枝进行营养繁殖较为普遍，但该繁殖方式存在占用空间资源大、成苗周期长及种苗价格高等问题(罗钱等, 2021)，利用植物组织培养技术可以对轮叶黑藻母本进行快速扩繁(Shasmita et al, 2018；孙敏杰等, 2012)，以解决我国轮叶黑藻野生苗来源不足的关键问题。

目前对轮叶黑藻组培苗的培养液成分、移栽基质及种植密度进行了大量的研究，形成了较为成熟的培养及种植体系(蒋金辉, 2007)。炼苗是使植株迅速适应环境，在定植前采取放风、降温、适当控水等措施对幼苗强行锻炼的过程。炼苗技术对于轮叶黑藻的生长发育至关重要，组培苗经过室内长时间的闭瓶生长，未经驯化直接移栽易出现品质不佳、倒苗死亡等现象。开盖炼苗可以短期内使组培苗重建自身的获得性抗逆性(Conrath et al, 2009)，例如张有铎(2010)和柳跃等(2014)通过此方法提高组培苗移栽存活率。但目前国内外关于轮叶黑藻组培苗在整个生长阶段生长生理指标变化及炼苗对其环境适应能力的影响研究较少。

通过探究轮叶黑藻组培苗的生长规律和环境适应能力，以期提高轮叶黑藻组培苗出苗品质及其快速适应新环境的能力，为轮叶黑藻组培苗产业化生产及工程化应用提供基础数据参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

轮叶黑藻在实验室中继代培养1年，选取成熟健壮、长势基本一致的植株，截取片段进行植物组织培养。

1.2 研究方法

1.2.1 植物组织培养试验按23.7:150:20:1的对应比例将MS培养液与蔗糖、BA、IAA等物质混合，配置组培苗基础培养液，pH值为5.6～5.8。将培养液置于高压灭菌锅内(121℃)灭菌30 min，再置于超净工作台中紫外杀菌30 min，待全部灭菌完成即可开始接种。其中组培苗的接种规格为：长2±0.2 cm、重0.2±0.01 g的成熟健壮轮叶黑藻片段。接种完成并封口后置于25℃恒温组培室中进行培养，在此期间密切观察组培苗生长情况以便及时剔除有菌苗。另一组组培架采取遮光处理以避免不同位置产生的光线干扰，固定光源与植物间距离为15 cm，灯与灯之间距离为10 cm。于培养后的第15 d、25 d、35 d、45 d、55 d分别取样，每次随机取6瓶，3瓶用于测量干重、鲜重、茎长、分枝数等生长指标，3瓶用于测叶绿素(Chl)等生理指标。

1.2.2 开盖炼苗试验基于预实验以及其他同类型实验的参考(陈彩霞等, 2004; 柳跃等, 2014)，本实验通过设置3种不同开盖炼苗时间(1 d、3 d、5 d)及3种不同光 周期(6 h/d、9 h/d、12 h/d)进 行3×3正交实验，每个处理重复3次。取闭瓶育苗完成且长势健壮的轮叶黑藻组培苗作为实验对象，将组培苗置于组培架内，对其进行9种不同条件的开盖炼苗处理，处理完成后将苗置于育苗袋中进行室外驯化培养，驯化用水取自实验当地公园湖水。室外驯化培养14 d后每个条件随机选取3株组培苗，用于测量可溶性糖、可溶性蛋白及叶绿素等生理指标。

1.2.3 样品指标测定方法鲜/干重测定方法为将待测轮叶黑藻样品所有根、茎、叶均收集起来，洗净后迅速用滤纸擦干测量鲜重(FW)，在60°C恒温烘箱中24 h后测定生物量干重(DW)。叶绿素含量测定采用丙酮乙醇混合液法(张宪政, 1986)；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝比色法(王学奎, 2006)；可溶性总糖含量测定采用蒽酮法(李合生, 2006)。

1.3 数据分析与处理

采用SPSS软件进行单因素方差分析、双因素方差分析、person相关性分析，采用Origin进行线性回归拟合，Graphpad prism软件绘制柱状图。

2 结果与讨论

2.1 组培苗生长生理指标分析

2.1.1 表型指标轮叶黑藻组培苗各表观形态指标整体呈增长趋势，并在培养25 d后，各指标均随着组培时间的增加而显著增加(P＜0.05)，干鲜重以及茎长等指标在第45 d分别增加了81.41%、157.72%、8.02%，分 枝 数 在 第35 d显 著 增 加66.67%(表1)。组培苗培养初期，因刚接种至瓶内新环境下，组培苗处于初期生长迟缓阶段，植物新陈代谢缓慢，故各项生长指标未出现显著上升。而后期随着组培苗对环境的不断适应，光合作用不断增强，逐步进入高速生长阶段，这与谢翔(2020)对草莓组培苗的研究结果相同。此外，轮叶黑藻组培苗各生长指标之间出现了异速增长，其中分枝数最先发生显著性变化，表明轮叶黑藻组培苗优先实现分支数的显著增加而后再加速茎长、干鲜重等生长。

表1 轮叶黑藻组培苗表型指标变化Table 1 Changes of apparent type indexes of H. verticillata tissue culture seedlings

2.1.2 生理型指标轮叶黑藻组培苗Chla与Chlb在组培育苗前35 d内始终处于下降趋势，自第25 d起Chla显著下降49.71%，Chlb显著下降40.65%(P＜0.05)(表2)。可能由于组培苗处于缓苗期，这与陈磊(2019)对白芨苗组培研究的结果一致；也可能由于组培室内光照过强，轮叶黑藻通过减少自身Chla、Chlb含量来减少单位面积Chl酶活性从而避免光氧化(Shigenaga et al, 1994; Salin et al, 1991; Pascal et al, 2005)。缓苗期后轮叶黑藻组培苗Chla与Chlb含量仍未上升，可能与瓶内没有足够的氮源供组培苗进行循环转化有关(苏敏, 2020)，而Chlb下降的原因可能是在植物体内Chlb往 往 由Chla转 化 形 成(Rüdiger, 2002)。尽管实验过程中轮叶黑藻组培苗Chla与Chlb始终未呈上升趋势，但其Chla/b在第45 d有显著提升，Chla/b是评价植物叶绿素浓度吸光度值的可靠性标准，也是反映植物光合作用能力的关键性指标(Lee, 2019)，该指标的提高说明本实验中组培苗的光合作用随时间增加有所增强。

2.1.3 生长指标相关分析为探究轮叶黑藻组培苗生长发育过程中内部生理生态变化与其表型变化之间的相关关系，为生长曲线拟合提供依据，对轮叶黑藻组培苗干鲜重、茎长等生长指标与Chl等生理指标进行相关性分析(表3)。其中轮叶黑藻组培苗各生长指标与Chla、Chlb等生理指标之间呈显著负相关(P＜0.05)，表明植物在生长发育时期不同生物指标之间存在一定差异性(许智宏等, 1998)，由表1、表2可知，轮叶黑藻各项生理性微观指标优先于其表型等宏观指标表现出显著性差异。此外，不同于Chla、Chlb等生理指标，轮叶黑藻组培苗的Chla/b指标与其生长指标之间呈显著正相关(P＜0.05)，其中鲜重与Chla/b的相关系数最高，达0.747，说明只有较高的Chla/b值，植物才能较好地进行光合作用及生长发育(金相灿等, 2008)。

表2 轮叶黑藻组培苗生理型指标变化Table 2 Changes of physiological type indexes of H. verticillata tissue culture seedlings

2.2 组培苗生长曲线拟合

由于轮叶黑藻组培苗干重含量较低(最小只有0.02 g)，容易因操作误差而对其数据结果造成较大影响，且组培后期组培苗繁殖较快，分枝数、芽数与叶片数混杂难以分辨及测量，所以本研究以时间为自变量，鲜重为因变量，对组培苗的生长曲线进行拟合，能较大程度减少误差。由表3的指标相关性分析可知，鲜重与其他表型指标之间存在极显著相关性(P＜0.01)，以鲜重变化来替代其它类型指标的变化也具有一定的科学依据。

表3 轮叶黑藻组培苗各生长指标相关性分析Table 3 Correlation analysis of growth indexes of tissue culture seedlings of H. verticillata

为模拟预测轮叶黑藻组培苗生长发育状况，本研究利用Logistic、Gompertz、Von Bertalanffy 3种模型对轮叶黑藻组培苗的生长情况进行模拟，拟合方程、拟合参数、R2以及拐点等值如表4所示。

表4 三种“S”型模拟表达式Table 4 Three "S" type simulation expressions

轮叶黑藻组培苗生长发育的实际拟合曲线如图1所示，图中黑色实心圆点代表实际鲜重测量值，3种拟合曲线在第15 d的拟合值均低于实际测量值，且存在较大误差率，随着育苗时间的增加，代表组培苗鲜重实测值的黑点较为均匀的分布在拟合曲线周围，尤其第25 d和第35 d，实测值几乎与3种模型的拟合曲线重合，说明模型在此阶段可高度模拟植物生长动态规律。

图1 轮叶黑藻组培苗生长曲线拟合图Fig.1 Growth curve fitting of H. verticillata tissue culture seedlings

为进一步比较各阶段不同模型拟合效果，表5将组培苗鲜重实测值与模拟数据之间进行对比。第15 d、25 d、35 d、45 d、55 d时，Logistic模 型 拟合误差率分别为54.05%、0.59%、4.26%、0.91%、0.15%。总体来看，随着时间的增加，拟合误差率逐步降低，曲线的拟合效果越好。分析原因可能是前期组培苗为适应新环境，扰乱了自身正常生长秩序，而后期通过自我调节适应新环境，恢复正常生长状态(Smithers et al, 2019)。

表5 实测值与模型数据比较Table 5 Comparison of measured value and model data

2.3 组培苗开盖炼苗生理指标分析

光周期为6 h/d和12 h/d时，开盖时间不会引起组培苗可溶性蛋白含量的显著变化(图2a)。当光周期为9 h/d时，轮叶黑藻组培苗的可溶性蛋白含量在开盖5 d时显著上升了20.49%(P＜0.05)，同时其含量在该背景下达到了最大值1.73 mg/L。开盖时间一定、光周期不同时，轮叶黑藻组培苗在9 h/d的光周期背景下，其可溶性蛋白含量均显著高于其他两组，当开盖时间为1 d、3 d、5 d时，相较于同一开盖时间下的6 h/d与12 h/d两组，轮叶黑藻组培苗可溶性蛋白含量均值分别提高了34.07%、56.32%。说明在9 h/d光周期的条件下，开盖驯化5 d可使轮叶黑藻组培苗获得较高可溶性蛋白含量。当光周期为12 h/d时，与9 h/d组相比，该组可溶性蛋白含量均显著下降，说明较长时间光照会降低轮叶黑藻组培苗的可溶性糖含量，与张爱玲(2009)对小麦的研究结果一致。孙岁寒等(2007)发现过长时间光照会影响藻细胞代谢抑制其生长，安彦君等(2016)也发现在24 h连续光照条件下，葛仙米的物质积累出现负增长，说明长时间光照会损害植物生长发育。

图2 轮叶黑藻组培苗可溶性蛋白（a）/糖含量（b）Fig.2 Soluble protein of H. verticillata tissue culture seedling(a)/ Soluble sugar(b)

光周期为6 h/d和12 h/d时，随着开盖时间的增加，轮叶黑藻组培苗可溶性糖含量逐步降低但未形成显著差异(图2b)。在开盖时间相同、光周期不同的条件下，轮叶黑藻组培苗可溶性糖含量均呈现6 h/d＞9 h/d＞12 h/d的趋势，但差异不显著。研究表明：可溶性糖等活性物质可以调节宿主植物渗透压，间接促进植物生长发育(Ribaut et al, 2002)，植物可以通过调整叶片中可溶性糖含量来提高自身的抗逆性(苏雅等, 2021; 李婧等, 2021)，故本实验中长光周期(12 h/d)不利于轮叶黑藻组培苗环境适应能力的获取。

3 结论

(1)在轮叶黑藻组培苗生长曲线拟合中，3种方程对其生长的拟合均具有较好效果，可一定程度上模拟其动态生长规律。46—48 d时间点附近是组培苗长势最旺盛的阶段，此阶段及时移栽可以获得长势健壮的轮叶黑藻组培苗，从而避免过度培养带来的出苗品质不佳及经济损耗等问题。

(2)在轮叶黑藻组培苗开盖炼苗过程中，炼苗条件对轮叶黑藻组培苗可溶性糖含量影响不大，但对其可溶性蛋白影响较大，且在长光周期(12 h/d)炼苗背景下会显著降低组培苗可溶性蛋白含量，为保证组培苗炼苗效果，应给予组培苗5 d开盖露苗处理及9 h/d光周期处理。