种植体骨结合中生物学过程与分子调控机制的研究进展*

张文静 王亚楠 徐 欣

近年来，口腔种植技术凭借其无需损伤邻牙且功能和美学效果好等优点,被越来越多的缺牙患者所接受，是目前一种重要的缺牙修复方式。这种临床治疗的成功在很大程度上依赖于牙槽骨内种植体的稳定结合和维护。种植体骨结合是指在光镜下观察，种植体和周围骨组织紧密接触，没有任何纤维组织等非骨组织介入种植体和骨组织之间［1］。良好的骨结合是口腔种植重要的生物学基础，其受到体内微环境，如多种信号分子和细胞内外基质的影响，并处在骨形成和重塑的动态过程中。通常情况下，种植体植入2h后，即可在伤口腔隙处观察到由红细胞，中性粒细胞，单核/巨噬细胞及纤维蛋白等形成的血凝块；4d后，血凝块逐渐被肉芽组织取代，肉芽组织中富含由炎症因子和生长因子募集而来的间充质干细胞及基质成分等；1周后，间充质干细胞数量继续增多，并在转录因子的作用下发生骨特异性基因的转录，促进干细胞向成骨细胞分化，与沉积矿化的细胞外基质共同形成编织骨；2-4周时，随着编织骨数量的增加，它开始逐渐被板层骨所取代，这进一步增强了种植体的稳定性；8-12周时，大部分编织骨被板层骨取代。同时，骨碎片及坏死骨的清除也在发生。因此种植体骨结合是一种动态过程，骨形成和骨重塑共同维持骨稳态的平衡［2］。

有研究［3］指出以大部分编织骨被板层骨替代的事件作为区分种植体骨结合早期和晚期的标志，一般发生在植入种植体后的8-12周。虽然晚期阶段具有相对成熟的骨组织并且与种植体表面的接触度更高，但是种植体骨结合的早期涉及活跃的生物学行为及复杂的分子调控机制，对于种植体初期稳定性起着至关重要的作用，因而受到广泛关注。目前很多研究尝试通过调控钛种植体表面的早期分子生物学反应，进而有针对性地改变种植体的表面形貌以提高种植体骨结合能力［4,5］。深入认知参与骨结合早期阶段的分子调控机制对于加速和加强骨结合过程，改善和扩大牙科种植系统的临床适应征具有重要意义。本研究的目的是对种植体骨结合早期过程中涉及的生物学过程及分子调控机制进行系统性综述，以期为寻找改善种植体骨结合的分子靶点和扩大种植修复临床适应征提供良好的理论依据。

1.骨免疫调节机制

钛及其合金作为外科植入物材料具有良好的生物相容性，目前已广泛应用在口腔科、骨科、神经外科等。但是在1992年Donath［6］就对钛的生物惰性现象产生质疑，他认为钛并非不会引起组织的任何不良反应，反而能够激发组织内的免疫反应。目前这种观点已被许多研究者所证实，Trindade等［7-9］认为商业纯钛种植体可以激活机体免疫反应，而骨结合实际是一种异物反应后的组织保护机制，即在钛种植体周围形成骨组织来稳定种植体。

研究表明，多种炎症细胞参与到种植体骨结合早期的免疫调控机制中，包括中性粒细胞、单核-巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞等等。在种植体植入后，血液中的中性粒细胞转移到种植体表面，由单核-巨噬细胞和上皮细胞分泌的白介素8（interleukin-8，IL-8）激活，进而分泌单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）以及巨噬细胞炎症因子1β（macrophage inflammatory protein-1β，MIP-1β）两种细胞因子，以强力激活巨噬细胞、单核细胞、树突细胞和淋巴细胞产生，从而介导不同的免疫反应。其中由于巨噬细胞高度的可塑性及其在免疫反应中的多重作用，逐渐被越来越多的学者关注［10-12］。

Shanbhag等［3］对早期种植体周围骨愈合的基因组进行分析，发现与炎症密切相关的肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、干扰素（interferon，IFN）家族在种植体植入后3-4d显著上调，到第7d时，与促炎细胞因子相关的基因白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-1α（interleukin-1α，IL-1α）和有抑炎作用的趋化因子配体18（chemokine (c-c motif) ligand18，CCL18）、趋化因子配体22 (chemokine (c-c motif) ligand 22，CCL22）分别下调和上调［13］，而且这种抗炎反应可由种植体的表面特性调节，比如［14］经活性亲水SLA(SLActive）处理的种植体与普通SLA种植体相比，其与炎症细胞增殖相关的基因显著下调的时间更早；相较于单纯微粗糙表面处理方式，经氢氟酸纳米涂层处理的种植体周围组织中与抗炎细胞因子相关的基因会显著上调［15］。Biguetti等［16］在小鼠口腔种植体骨结合过程中，发现大量炎性因子的表达水平在种植后第7d达到顶峰，其中精氨酸酶1（arginase，ARG1）和白介素10（interleukin-10，IL-10）两种炎症因子的表达正是M2型巨噬细胞对于创伤愈合做出的反应。Trindade等［7］比较兔股骨钛种植体组和假手术组不同时间点所激活的免疫系统的基因表达时发现在第10d时，ARG1在钛种植体周围显著上调，提示了M2巨噬细胞活化。Thalji等［13］采用全基因组微阵列分析发现虽然两种处理方式种植体骨整合早期的分子表达在同一时间点无显著差异，但第7d时与M2型巨噬细胞活化相关的标志物较第3d时明显上调，而炎症反应随之下调，也提示了M2型巨噬细胞对于加速骨整合具有重要意义。Chen等［17］发现在LPS构建的炎症微环境中，含Zn涂层的钛纳米管种植体会使M2型巨噬细胞相关基因表达增强，抑制M1型相关标志物表达。Li等［18］就发现硫酸软骨素/聚多巴胺修饰聚对苯二甲酸乙二醇酯移植物可以调控M1型巨噬细胞向M2型转变，促进促修复细胞因白介素4（interleukin-4，IL-4）、IL-10分泌，通过改善局部免疫微环境，引导干细胞的行为，促进新骨形成。

种植体骨结合早期的免疫反应在一定程度上影响后期种植体周围的骨愈合，并且这种免疫反应受到种植体表面特性的调控。因此，充分利用巨噬细胞的可塑性，并进行合理的种植体表面修饰可能是改善种植体早期骨结合的潜在突破点。

2.成骨细胞基因表达

在胎儿期及出生后骨形态发生和发育过程中，可人为的将成骨分化途径的细胞分为：未分化间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、成骨祖细胞、前成骨细胞、成骨细胞和成熟骨细胞，但实际上它们之间并没有明显的区分界限［19］。在这一过程中大量细胞因子、生长因子通过Ras/MAPK、TGF-β/BMP和经典的Wnt/β-catenin在内的一系列信号转导通路［20,21］介导MSCs的募集和分化。它们通过激活runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、锌指结构转录因子（osterix，Osx）、同源异形框（Dlx3、Dlx5、Msx1、Hox）等基因的表达促进骨特异性基因的转录，并指导MSCs有序的成骨分化。其中转录因子Runx2和Osx被认为具有“主开关”的作用，是成骨细胞分化的绝对要求。

Monjo等［22］报道了具有中等粗糙表面的钛种植体的拔出力和贴壁组织面积还有稳定的成骨细胞标记基因的mRNA水平呈正相关。Guo等［23］观察大鼠胫骨种植体早期骨结合过程中的成骨基因表达情况，发现第3d时Runx2，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，Alp）表达明显上调，第7d时除了Runx2，Alp继续上调外，骨涎蛋白（bone sialoprotein，Bsp）的水平也显著升高。Du等［24］观察到假手术组大鼠上颌骨的Alp、骨钙蛋白（osteocalcin，Ocn）、Ⅰ型胶原（collagen1，Col1）在3-7d显著上调，但是雌激素缺乏所致的骨质疏松大鼠并没有显示出成骨基因表达的增加，表明雌激素缺乏在早期愈合反应中干扰了成骨细胞的成骨能力；Bryington等［15］观察人下颌种植体早期骨结合过程中成骨基因表达情况，发现第1d的时候没有明显骨诱导现象出现，第3d时骨形态发生蛋白6（bone morphogenetic protein6，Bmp6）、骨桥蛋白（osteopontin，Opn）和Osx水平就明显升高，第7d时，虽然两组均有成骨基因的表达，但酸蚀处理组Osx和Ocn的表达显著高于喷砂组。Jimbo［25］也发现在兔胫骨种植体骨结合过程中，第4周时纳米磷酸钙涂层处理组种植体周围组织中Alp和Ocn的表达水平显著高于对照组。Fang 等［26］则证实了应用Ca-antimiR138复合物修饰种植体表面可使MSCs成骨诱导过程中ALP活性提高至10倍以上。并且大量研究［27］证实种植体的纳米地貌具有引导MSCs向成骨方向分化的潜力。

也就是说成骨细胞标记基因在种植体周围组织表达的时间过程不仅遵循成骨细胞分化过程中的时间基因表达模式，而且峰值表达时间点在一定程度上会受到种植体类型、材料和表面形貌的影响，其中表观遗传调控、翻译和翻译后修饰［28,29］从分子水平上解释了不同种植体表面处理方式对成骨基因表达差异的原因。

3.成骨细胞外基质的分子调控作用

完全分化的成骨细胞可分泌细胞外基质（extracellular matrix，ECM)，ECM有利于新骨沉积，是早期骨形成的基础［30］，主要成分包括各种胶原蛋白（Collegen，COL）和非胶原蛋白（OPN、骨粘连蛋白、OCN、BSP、骨膜蛋白、细胞外基质蛋白-1、层粘连蛋白、整合素等）。而且细胞外基质蛋白的表达可作为早期成骨活性的可靠指标［31］评估种植体骨整合效果。

3.1 非胶原蛋白 骨桥蛋白是一种对于矿化十分重要的细胞外基质蛋白，Donos等［14］发现其在SLActive种植体植入7d后的周围组织中表达明显升高。骨钙蛋白具有骨特异性，是成骨分化晚期的标志ECM蛋白，相较于微粗糙表面种植体，其在经氢氟酸纳米涂层表面处理的种植体周围组织中表达更高［15］。Ozawa等［32］观察到相比于种植体植入前，种植体的植入后会显著升高ECM中骨粘连蛋白、骨涎蛋白和整合素的表达水平。

3.2 胶原蛋白 胶原蛋白约占ECM的90%，其中含量最多的是COL1。由胶原蛋白交联而成的胶原纤维决定了骨的生物力学性能［33］。除胶原蛋白外，与胶原纤维形成、加工和翻译后修饰相关的蛋白也与ECM的生成相关，影响种植体早期骨结合的机械强度。

Ozawa等［32］观察到相比于种植体植入前，植入后会显著升高Col1A1，Col3A1的基因表达水平。Thalji等［13］通过基因芯片技术对人的种植体骨结合早期分子表达进行评估时发现，与3d时相比，第7d ECM中的Col1A1，Col1A2，Col3A1，Col6A1，Col6A3以及胶原纤维形成相关的基因，如热休克蛋白-47（heat-shock protein-47，Hsp47）、前胶原蛋白c -内肽酶增强剂（procollagen C-endopeptidase enhancer，Pcolce），表达量显著升高。胶原蛋白转变为成熟的胶原纤维需要经过一系列翻译后修饰，特别是发生在脯氨酸和赖氨酸残基上，由脯氨酰4-羟化酶（prolyl-4-hydroxylases，P4H)，脯氨酰3-羟化酶（prolyl-3-hydroxylases，P3H)，或赖氨酰羟化酶（lysyl hydroxylases，LHs）介导的羟基化修饰对胶原交联起着重要作用［34］，在这些生物合成步骤中涉及的任何蛋白质都可能影响最终的骨结合效果。研究发现［35］编码P3H的基因突变后会导致胶原蛋白缺乏羟基化修饰而引起严重的常染色体隐性骨形成不全症，P4H的杂合错义突变会造成尖头多指（趾）并指（趾）畸形［36］。Ogawa等［37］通过差异显示PCR法筛选，P4H被鉴定为在种植体植入后显著性上调的基因，Thalji等［13］发现种植体植入7d后编码LHs的基因表达水平明显升高，表明种植体诱导的P4H或LHs的上调可能有助于胶原交联的增加，从而增加种植体周围骨组织的硬度和刚度。表明了调节骨胶原基质翻译后修饰的基因网络可能在改善种植体周围骨的力学性能方面发挥重要作用。

因此成骨ECM蛋白不仅可以作为早期成骨活性的可靠指标，而且胶原蛋白通过交联形成的胶原纤维有利于早期骨的成熟，并保证成熟骨组织具有稳定的结构、良好的强度和弹性。

4.破骨细胞活性与骨重塑

骨稳态的维持需要成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间的平衡调节。种植体骨结合过程中，成骨细胞介导的骨形成作用如第2部分所述，破骨细胞介导的骨吸收也同样扮演着非常重要的作用。核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体/骨保护素（RANK/RANKL/OPG）是调控破骨细胞分化的重要信号通路，该信号通路激活时可以促进破骨细胞向分化［38］。另外，成骨细胞可通过RANKL刺激破骨细胞的活化，还可通过分泌OPG密切调控这一过程［39］。一项采用全基因组微阵列分析人骨整合过程早期分子表达的研究［13］发现，与3d相比，7d时可降解多种细胞外基质的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、破骨细胞活化标志物组织蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）以及抗酒石酸酸性磷酸酶（type 5 acid phosphatase 5，ACP5）明显升高。另外两项体内研究也报告了这三者的升高。同样地，Biguetti等［16］在小鼠口腔种植体骨整合的骨重塑过程中，发现MMPs（MMP1，MMP2，MMP9）、RANKL和OPG表达在植入种植体后逐渐上调并在第14d达到峰值，随之破骨细胞数量逐渐增加。Lenneras等［40］在大鼠胫骨进行的一项体内研究关注到了，阳极氧化种植体会比普通机械加工种植体更早地诱导破骨细胞分化和随后更强地骨重塑，从而加速骨-种植体界面的成熟。但是，Thalji［13］同时发现MMP抑制剂（TIMP-2，TIMP-3）在种植体表面也有上调，表明了机体对骨吸收过程的控制。有体外研究［41］发现培养人骨髓MSCs7d后，与SLA表面相比，SLActive表面破骨细胞相关基因显著下调；另外有研究［42］证实具有槲皮素涂层的种植体具有良好的生物相容性和在体内外实验中降低破骨细胞形成的能力，可用于改善种植体的性能。

总之，这些数据证实了骨结合的早期阶段骨吸收的动态变化，并提出了种植体表面技术调节骨重塑的可能性。

5.总结

种植体骨结合早期过程中的免疫反应、成骨相关基因的时空表达、成骨细胞外基质的调控、破骨细胞活性改变及骨重塑等分子事件共同作用，形成了调控早期骨结合的复杂网络，在改善种植体-骨结合界面的独特生物、物理特性方面发挥了关键作用。但除此之外的血管形成、神经生成等骨代谢相关机制尚不明确，因此仍需要进一步通过基因组筛选、组学研究和生物信息学分析等手段全面了解与种植体骨结合相关的分子网络，以筛选出可用于改善种植体骨结合的治疗靶点，为提升种植修复效果提供良好的理论依据。