外源钙浸种对小麦防御酶和麦二叉蚜体内解毒酶活性的影响

王 骏，吴小保，宋 佳，邓倩倩，曾 广，任明见，叶 茂，*

(1.贵州大学 昆虫研究所，贵州 贵阳 550025；2.贵州省山地农业病虫害重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.国家小麦改良中心贵州分中心，贵州 贵阳 550025)

小麦(TriticumaestivumL.)是重要的粮食作物[1-2]。麦二叉蚜[Schizaphisgraminum(Rondani)]及其传播的大麦黄矮病毒(BYDV)严重影响小麦品质和产量的提高，但长期大量使用农药会导致麦二叉蚜抗药性持续增强，使控蚜工作变得更加艰巨[3]。为了更好地防治麦二叉蚜，亟须寻找有效且环境友好的新方法。

植物能识别植食性昆虫为害，并系统性地在形态、生理、生化等多个层面做出特异性的防御反应，如植物腺毛、叶面蜡质、角质层、细胞壁等均会阻碍蚜虫取食[4]。此外，植物体内的保护酶、防御酶、蛋白酶抑制剂等在防御过程中也发挥着十分关键的作用[5]。防御反应按时间维度一般可分为组成型和诱导型防御2类[6]。其中，组成型防御是预先形成的；而诱导防御反应则表现为一系列活性氧信号物质的合成，及其诱导下游植物激素介导的防御反应[7]。在植物进行防御的过程中，过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和β-1，3葡聚糖酶(β-1，3-GA)等在植物的胁迫应答过程中扮演着重要的角色[8-9]。研究发现，抗蚜品种的小麦遭受禾谷缢管蚜[Rhopalosiphumpadi(Linnaeus)]取食后，叶片中的超氧化物歧化酶(SOD)、POD和PPO活性显著高于感蚜品种[10]，PAL、酪氨酸解氨酶(TAL)、POD、Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATPase)、Mg2+-ATP酶(Mg2+-ATPase)的活性亦显著高于感蚜品种[11]；抗蚜品系的小麦在遭蚜虫取食后，叶片的PAL、POD、几丁质酶活性急剧上升，而上述酶的活性在感蚜品系小麦的叶片中虽然也有上升，但上升缓慢[12]。这些研究结果均显示，防御酶活性的提高是小麦抗蚜的重要因素[13]。

面对植物的防御体系，植食性昆虫演化出多种反防御机制以维持种群发展，包括行为防御、生理防御和生物化学防御机制[14]。研究发现，昆虫能利用自身的解毒酶系统对摄入体内的有毒物质进行解毒[15]。昆虫的解毒酶系主要存在于昆虫的中肠、线粒体、脂肪体和高尔基体中，可将亲脂性的物质分解转化为亲水性的物质，从而加速溶解和排泄，其中，谷胱甘肽巯基转移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarE)和细胞色素P450(CYP450)是昆虫体内重要的解毒酶[14，16]。研究发现，麦长管蚜[Sitobionavenae(Fabricius)]取食生物碱含量高的抗蚜小麦品种后，其体内CarE活性显著升高[17]；麦长管蚜取食经不同浓度氧肟酸处理的小麦植株后，其体内过氧化氢酶(CAT)、CYP450和GSTs活性均随着氧肟酸浓度的增加而显著增加[18]。以上研究表明，蚜虫在与小麦互作的过程中可通过提高防御酶活性的方式来减少对方带来的伤害。

利用外源物诱导来提高植物抗性是目前病虫害综合防治领域的研究热点[19-20]。近年来，大量的研究发现，昆虫口腔分泌物[21]、自身挥发的气体物质，以及取食诱导的植物挥发物[22-23]均可显著诱导植物的抗虫性，一些金属元素(如铜、钾等)[24-26]和非金属元素(如硅)[27-28]也可以显著诱导植物的抗虫性。钙元素是植物生长发育必需的营养元素，外源钙处理可以显著提高植物对非生物和生物逆境胁迫的抗性[29-30]；但关于钙在生物逆境胁迫方面的研究主要集中于植物病害领域，缺乏对虫害的研究。而且，在本研究检索范围内，关于外源钙介导下植物与害虫的互作关系也未见报道。为此，本文以紫粒小麦贵紫1号和麦二叉蚜为研究对象，采用氯化钙(CaCl2)浸种的方式对小麦进行外源钙处理，比较经外源钙处理后的小麦植株遭受麦二叉蚜取食后防御酶活性的变化，以及麦二叉蚜取食经外源钙处理的小麦植株后其体内解毒酶活性的变化，探讨外源钙介导下小麦和蚜虫间的相互作用关系，以期为有效防控蚜虫提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 供试植物与昆虫

小麦品种贵紫1号由贵州大学农学院小麦研究中心提供。

麦二叉蚜采自国家小麦改良中心贵州分中心，在人工气候箱[温度(25±1)℃，相对湿度(60±10)%，光/暗周期14 h/10 h]内用贵紫1号麦苗饲养30代以上供试。

1.2 实验方法

CaCl2浸种(T)处理：挑选健康饱满的小麦种子，经10%(体积分数)过氧化氢灭菌10 min，蒸馏水冲洗3次后，用20 mmol·L-1CaCl2浸泡48 h，对照(CK)用水进行浸种处理。待各处理种子露白后播种于塑料杯中，并置于人工气候箱(培养条件同上)中培养，待小麦长至两叶一心时备用。

蚜虫取食处理：在各处理小麦植株第2片叶的正面接入20头3龄麦二叉蚜取食，用透明塑料筒罩住塑料杯(顶端带有纱网)防止蚜虫逃逸。分别在麦二叉蚜取食0、24、48、72 h时收集不同处理的小麦叶片，检测叶片防御酶活性。收集取食各处理植株叶片0、24、48、72 h的蚜虫，检测其体内解毒酶活性。各项指标重复测定3次。

1.3 测定指标

1.3.1 POD、PPO活性检测方法

将待测小麦叶片(0.1 g)放置于2.0 mL离心管中，加入1 mL 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液[内含5%(质量分数)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，pH值为7.2]，在冷冻研磨机上研磨。研磨完成后，涡旋振荡10 s，于冷冻离心机中4 ℃条件下12 000×g离心15 min，取上清液(酶液)用于酶活性检测。POD活性参照袁庆华等[31]的方法，采用愈创木酚法测定；PPO活性参照吴文华等[32]的方法，采用邻苯二酚法测定。酶活性以单位时间单位质量蛋白所含有的酶活单位(U·min-1·mg-1)表示。

1.3.2 PAL、β-1，3-GA、GSTs、CarE和CYP450活性检测方法

分别按照苯丙氨酸解氨酶活性检测试剂盒、β-1，3葡聚糖检测试剂盒、谷胱甘肽巯基转移酶活性检测试剂盒和羧酸酯酶活性检测试剂盒说明书检测PAL、β-1，3-GA、GSTs和CarE的活性，以上试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，酶活单位为U·mg-1。按照昆虫细胞色素P450测试盒说明书检测CYP450活性，该试剂盒购自南京建成生物科技有限公司，酶活单位为ng·mg-1。

1.3.3 蛋白含量检测

采用Bradford[33]方法检测蛋白含量，使用牛血清蛋白作为标准蛋白。

1.4 数据处理与分析

利用Microsoft Excel 2016软件进行数据整理，在SPSS 21.0软件中进行统计分析。用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验同一处理不同时间段酶活性间的差异显著性(显著性水平α=0.05)，用Student’st-test检验同一时间不同处理间的差异显著性(显著性水平α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 对小麦叶片防御酶活性的影响

麦二叉蚜取食和氯化钙浸种处理均对小麦叶片的防御酶活性有显著影响，且防御酶活性的变化还与麦二叉蚜的取食时间有关(图1～4)。

柱上无相同字母的表示同一处理不同时间酶活性差异显著(P<0.05)，标“*”的表示同一取食时间不同处理间酶活性差异显著(P<0.05)。下同。

CK处理下，小麦遭麦二叉蚜取食24、48、72 h时，叶片POD和β-1，3-GA活性均显著升高，分别在取食48 h和72 h时活性最高；叶片PPO活性在72 h时与24、48 h时相比显著降低，但24、48、72 h时的PPO活性与取食前(0 h)均无显著差异；叶片PAL活性随着取食时间的增加呈先降低后上升的趋势，在24 h时最低，在72 h时最高。

T处理下，小麦遭麦二叉蚜取食24、48、72 h时，叶片POD和β-1，3-GA活性均显著升高，分别在48 h和72 h时活性最高；麦二叉蚜取食48 h时，叶片的PPO活性显著高于取食前，但其他时间段的叶片PPO活性无显著差异；叶片的PAL活性在24 h时显著低于取食前，其他时间段的叶片PAL活性无显著差异。

未遭麦二叉蚜取食时，T处理小麦叶片的PAL和β-1，3-GA活性分别比CK显著升高78.11%和18.92%。遭麦二叉蚜取食24、48、72 h，T处理小麦叶片的POD、PAL、β-1，3-GA活性分别比相同取食时间下的CK处理显著升高92.01%、66.11%、44.64%(24 h)，10.12%、12.60%、12.31%(48 h)和178.32%、163.05%、100.56%(72 h)；遭麦二叉蚜取食48、72 h时，T处理小麦叶片的PPO活性分别比相同取食时间下的CK处理显著升高21.66%、13.66%。

图2 不同处理对小麦叶片多酚氧化酶(PPO)活性的影响

图3 不同处理对小麦叶片苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响

图4 不同处理对小麦叶片β-1，3葡聚糖酶(β-1，3-GA)活性的影响

2.2 对麦二叉蚜体内解毒酶活性的影响

麦二叉蚜未取食小麦时(0 h)，CK和T处理下其体内解毒酶GSTs、CarE和CYP450的活性均无显著差异；取食后，CK和T处理下麦二叉蚜体内3种解毒酶的活性发生显著变化(图5～7)。

图5 不同处理对麦二叉蚜体内谷胱甘肽巯基转移酶(GSTs)活性的影响

CK处理下，麦二叉蚜取食小麦后，其体内GSTs活性随取食时间的增加呈降低趋势，在48 h和72 h时显著低于取食前；CarE活性在不同取食时间间无显著变化；CYP450活性仅在48 h时显著高于取食前。T处理下，麦二叉蚜取食小麦后，其体内GSTs活性在不同取食时间间无显著变化；CarE活性随取食时间的增加呈逐渐上升的趋势，在48 h和72 h时显著高于取食前；CYP450活性在24、48、72 h时均显著高于取食前。

图6 不同处理对麦二叉蚜体内羧酸酯酶(CarE)活性的影响

图7 不同处理对麦二叉蚜体内细胞色素P450(CYP450)活性的影响

与取食CK处理的相比，麦二叉蚜取食T处理的小麦后，其体内GSTs活性在48 h和72 h时分别显著升高259.60%和227.00%，CarE活性在24、48、72 h时分别显著升高32.81%、36.06%和48.54%，CYP450活性在24 h和72 h时分别显著升高7.95%和23.40%。

3 结论与讨论

尽管植物会启动一系列的诱导防御系统来应对蚜虫的为害，但蚜虫仍然能“攻破”甚至可以“操控”寄主植物的防御系统，并成功地在寄主植物上生存和繁殖[34-35]。蚜虫作为农业上重要的刺吸式口器昆虫，其独特的取食方式和特化的口针决定了其与寄主植株互作的复杂性，因而研究蚜虫的反防御机理有助于新型抗蚜植株的筛选和培育。

POD、PPO、PAL和β-1，3-GA是植物上重要的防御酶，在植物应对害虫胁迫的应答过程中扮演着重要的角色[8-9]。POD是维持植物体自由基平衡的关键防御酶，可参与防御物质中酚类和醌类等化合物的合成，抑制昆虫的生长[8，36]。PPO是催化植物体酚类物质生成木质素和醌类化合物的关键酶，可减少害虫对植物营养的获取[37-38]。PAL是植物体内次生代谢反应的关键酶和限速酶，在植物损伤信号传导和防御虫害中发挥着重要作用[8，39]。β-1，3-GA是一种主要分布于寄主细胞质膜和细胞壁的重要水解酶，可以水解病原菌的细胞膜，减轻植物病害[14，40]。寄主植物的防御酶活性与其抗虫能力密切相关，通常，抗性越高的品种，其防御酶的活性越强[40-41]。张廷伟等[10]和Xu等[11]研究发现，禾谷缢管蚜取食为害后，抗蚜品种叶片中的SOD、TAL、POD、PPO和PAL活性均显著高于感蚜品种。本试验结果表明，CK处理下，小麦植株遭麦二叉蚜取食后，其叶片POD、PAL和β-1，3-GA活性均不同程度升高，说明这3种防御酶在小麦植株抵御麦二叉蚜取食为害的过程中发挥着重要的作用。经外源钙浸种处理的小麦植株，其叶片PAL和β-1，3-GA活性在遭麦二叉蚜取食前显著高于CK处理的植株，遭受蚜虫取食后，其活性也更强。蚜虫取食前，T处理小麦叶片的POD和PPO活性与CK相比并无显著差异；但当蚜虫取食后，这2种酶的活性也显著高于CK。这些结果表明，经外源钙浸种处理的小麦，其防御酶活性更强，这有利于提高小麦对蚜虫的抗性。相似的现象在其他学者的研究中也有报道：王祎等[25]研究发现，钾可以显著提高小麦脂氧合酶(LOX)、POD、PAL和POD活性，降低麦长管蚜的种群数量；Zeng等[7]也发现，叶片喷施氯化钙可以显著增强PAL和β-1，3-GA活性，提高菜豆(PhaseolusvulgarisLinn.)植株对西花蓟马[Frankliniellaoccidentalis(Pergande)]的抗性。

解毒酶是昆虫体内主要的防御酶，主要包括GSTs、CarE和CYP450[14，16]。GSTs是在昆虫代谢过程中具有多种生理功能的一类活性蛋白质，不仅参与多种植物次生物质的代谢，还参与杀虫剂的代谢[42-43]。CarE能有效催化酯类和酰胺类化合物的水解，与多种药物、环境毒物、致癌物的解毒和代谢有关[44]。CYP450介导的多功能氧化酶是昆虫体内参与各类杀虫剂，以及其他外源性和内源性化合物代谢的主要解毒酶系[45]。本研究表明，麦二叉蚜取食CK处理的小麦植株24、48、72 h后，其体内GSTs活性逐渐降低，CarE活性无显著变化，CYP450活性只在取食48 h时显著高于取食前；而取食T处理的小麦植株后，麦二叉蚜体内GSTs、CarE和CYP450活性在不同取食时间显著高于取食CK处理小麦植株的蚜虫，结合小麦叶片POD、PPO、PAL和β-1，3-GA酶活性的变化情况，推测是麦二叉蚜为了应对小麦植株升高的抗性，其体内GSTs、CarE和CYP450活性也相应增强。Lan等[46]对取食抗蚜品种和感蚜品种的麦长管蚜进行转录组比较分析，发现取食抗性小麦品种后，麦长管蚜体内18个与解毒代谢的基因显著上调；牟少飞等[47]也发现，烟粉虱[Bemisiatabaci(Gennadius)]取食含有低剂量槲皮素的饲料后，其体内CarE和GSTs活性显著升高；董均锋等[48]发现，烟青虫(Heliothisassulta)取食含有烟碱和辣椒素的人工饲料后，体内GSTs活性显著升高。以上研究结果均与本研究结果一致，说明GSTs、CarE和CYP450在昆虫解毒或适应寄主防御系统的过程中发挥着重要的作用。

综上，本研究发现，外源钙对小麦植株中的防御酶活性有明显诱导作用。麦二叉蚜取食经外源钙处理的小麦植株后，其体内解毒酶的活性也相应升高，以应对小麦植株增强的抗性。然而，外源钙介导下小麦与蚜虫的互作关系不只局限于二者体内酶活性的变化，关于取食和选择行为等方面的互作机理等还有待继续研究。