三裂叶豚草花粉新型过敏原钙结合蛋白分子克隆，表达及致敏活性

张成，王涵，许志强，朱丹萱，魏继福

豚草原产于北美洲的沙漠地区，于20世纪30年代传入中国，并在我国辽宁、新疆、北京、山东、上海、河北、江苏、湖南、四川等20多个省市自治区发生[1-3]。豚草花粉是气传花粉，具有很强的致敏性[4],其中，三裂叶豚草是豚草花粉中变应性较强的一种[5]，花粉颗粒较小，仅有18～20 μm，容易进入上呼吸道，引起变态反应，是秋季花粉症的主要变应原[6-8]。

目前，钙结合蛋白(polcalcin)的致敏性在多个物种中均有报道，是花粉、甲壳类食物等的交叉过敏原[9-12]。本研究通过转录组学对三裂叶豚草花粉过敏原钙结合蛋白Amb t polcalcin1进行鉴定，并对Amb t polcalcin1基因进行克隆、诱导表达，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹试验(Western Blot)研究Amb t polcalcin1基因的致敏性，并进行同源性分析。

1 材料与方法

1.1 材料

三裂叶豚草花粉的转录组测序由北京奥维森基因科技有限公司完成，引物序列合成和克隆菌基因测序由南京擎科生物科技有限公司完成。RNA逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒、T/A克隆试剂盒、DNA胶纯化试剂盒、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)等购于宝生物工程(大连)有限公司(大连Takara公司)，重组克隆试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 过敏患者血清纳入标准

每例患者抽取血清样本4 mL，3 000 r/min离心5 min，采用Phadia1000荧光酶免疫检测(ImmunoCAP)系统检测患者血清中sIgE浓度。检测范围0.1 kUA/L和100 kUA/L，以0.35 kUA/L为阈值，sIgE结果≥0.35为阳性[13]。所有患者血清三裂叶豚草花粉的sIgE浓度均为阳性。

1.2.2 三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1基因信息、扩增和克隆

根据转录组测序结果，使用BLAST序列比对工具，将测序得到的序列与数据库(IUIS)报道的已知钙结合蛋白序列进行比较，得到一个潜在的钙结合蛋白序列，并根据全长设计引物(图1)，进而进行PCR扩增、T/A克隆和重组克隆。

图 1 三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1核苷酸序列和氨基酸序列Fig 1 Nucleotide and amino acid sequence of Ambrosia trifida pollen Amb t polcalcin1

1.2.3 三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1表达

重组克隆后，对重组菌液进行质粒提取，转化到BL-21(DE3)感受态细胞中，使用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(终浓度为1 mmol/L)进行诱导，筛选成功表达的菌落进行大规模诱导培养。

1.2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法，将纯化的三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1(浓度为10 μg/mL)于4°包被过夜，豚草花粉过敏患者的血清按照1∶10稀释作为ELISA试验的一抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗板3次后，加入anti-IgE孵育1 h，使用TMB进行显色。

1.2.5 免疫印迹试验(Western blot)

采用免疫印迹试验(Western blot)方法，将10 μg三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1上样后进行Western blot试验，以ELISA结果阳性血清按照1∶10进行稀释作为一抗，使用anti-IgE作为二抗，化学发光显影检测。

1.2.6 三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1保守性分析

根据鉴定出的三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1的氨基酸序列信息，利用ESPript3.0软件与其他物种中的Amb t polcalcin1进行多重序列比对，明确三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1中高度保守的氨基酸序列。

2 结果

2.1 三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1基因扩增和基因克隆

三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1 PCR扩增后，进行琼脂糖电泳，得到大小约300 bp的片段(图2)，对目的片段切胶回收后进行TA克隆和重组克隆，并送公司测序。三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1序列编码区共有249个碱基，编码83个氨基酸(图1)。其中，PCR前引物：F:AGGAAACAA TTATGGCAGAGGACG，后引物R:GAGAGGCATT ACCCAAACAATCAC；重组前引物F:CAGCAAAT GGGTCGCGGATCCATGGCAGAGGACGAAGAC，后引物R:GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAGAATATCTTGCCAAC。

图 2 三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1 PCR扩增结果Fig 2 PCR amplification of Ambrosia trifida pollen Amb t polcalcin1M：DNA marker DL2000；1:三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1基因扩增; bp:碱基对

2.2 三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1诱导表达

提取重组菌质粒，用IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE筛选成功表达的菌落，结果显示，三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1蛋白形式在相对分子质量10 000附近表达(图3)。

图 3 三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1蛋白诱导表达Fig 3 Expression of Ambrosia trifida pollen Amb t polcalcin1M：蛋白marker26616;A：未诱导菌;B：诱导菌;C：超声裂解后诱导菌上清;D：超声裂解后诱导菌沉淀(包涵体);E：纯化蛋白，箭头代表重组钙结合蛋白Amb t polcalcin1; Mr:相对分子质量

2.3 三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1 ELISA分析

收集100份三裂叶豚草花粉过敏患者的血清，进行ELISA试验。以11份阴性血清的吸光度值计算，其中cut-off用x+3s表示，结果为0.232 99，即图中虚线位置。ELISA结果显示，100份患者血清中14份血清的ELISA值高于cut-off值，阳性率为14%(图4)。

图 4 三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1 ELISA

2.4 三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1 Western blot

14份ELISA阳性血清进行Western blot分析，用2份阴性血清作对照。结果显示，编号13、22、30、62的4份血清含有IgE且能与三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1结合，显示阳性条带(图5)。

图 5 三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1 Western blot结果

2.5 三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1保守性分析

通过ESPript3.0软件比对分析，三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1与赤杨、艾属、豚草属等序列具有较高的一致性(图6)，其中，三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1与其近缘物种豚草属花粉中两个Amb t polcalcin1过敏原Amb a 9.0101和Amb a 9.0102的同源性最高，分别为95.18%和93.98%。与藜草Che a 3.0101、狗牙根Cyn d 7.0101、油橄榄Ole e 3.0101、紫丁香Syr v 3.0101的一致性分别为79.07%、75.90%、82.14%、80.72%。

图 6 三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1的系统进化树

3 讨论

豚草是一种世界性公害植物，虽然各个种类的豚草变应原不一致，但具有一定的相似性，能够激发交叉反应[14-16]。豚草是一种非常重要的气传变应原，研究发现，在对200例花粉过敏的患者进行随机抽样实验，发现有11%的人对豚草过敏，可导致哮喘和季节性过敏性鼻炎[17]。而在抗原皮肤变态反应试验检查中显示，辽宁省沈阳市因豚草花粉过敏的患者有上万人，其中气传致敏花粉主要以三裂叶豚草为主，其在花期能够产生大量致敏性极强的花粉，导致易感人群出现变态反应[18-19]。豚草花粉的主要致敏成分是蛋白质，因此分离纯化花粉中的致敏蛋白组分，明确其变应原的特征具有十分重要的作用。

本研究采用ImmunoCAP系统检测患者血清中sIgE浓度，以0.35 kUA/L为阈值，sIgE结果≥0.35为阳性。结果显示，所有患者血清中三裂叶豚草花粉的sIgE浓度均为阳性，以此鉴定出血清中抗体为IgE。之后，对三裂叶豚草花粉新型过敏原钙结合蛋白Amb t polcalcin1及其致敏性进行分析。通过多重比对分析发现，三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1与其近缘性物种豚草花粉中已经报道的两种Amb t polcalcin1过敏原具有非常高的保守性，氨基酸序列的一致性分别为95.18%和93.98%，与其他物种的Amb t polcalcin1过敏原的氨基酸序列一致性比例也在70%以上。在对患者血清中sIgE浓度检测时，ImmunoCAP系统是针对矮豚草进行检测，基于血清sIgE结果开展ELISA活性试验，本研究中鉴定的三裂叶豚草花粉过敏原，使用该血清获得ELISA阳性结果也是交叉反应的结果，与进化树分析序列的保守性和同源性结果一致。进一步对三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1的免疫活性进行分析，发现其致敏率为14%，这与已经报道的其他物种polcalcin的致敏率[20-21]相似。

综上所述，本研究发现三裂叶豚草花粉新型过敏原钙结合蛋白Amb t polcalcin1与其他多种物种中的Amb t polcalcin1过敏原具有较高的同源性。三裂叶豚草花粉新型过敏原钙结合蛋白Amb t polcalcin1在豚草花粉过敏患者的致敏率为14%，与其他物种Amb t polcalcin1致敏率类似。以上结果进一步完善了三裂叶豚草花粉Amb t polcalcin1的致敏原信息，为低致敏疫苗的研制提供理论基础。