MMP3在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

戎银芳，赵玲娜，宗刚军，赵海滨△

(1.中国人民解放军联勤保障部队第904医院病理科，江苏无锡 214044；2.苏州市中西医结合医院病理科，江苏苏州 215101；3.中国人民解放军联勤保障部队第904医院心内科，江苏无锡 214044)

肺癌是呼吸系统常见的恶性肿瘤，发病率和病死率均位居世界前列，其中约85%为非小细胞肺癌(NSCLC)。大多数肺癌患者确诊时已是中晚期，其5年生存率不到20%，即使经过手术治疗仍容易转移和复发[1-3]。肿瘤转移是一个复杂的多步骤、多环节的级联反应过程，包括局部侵袭、肿瘤细胞渗入血管和肿瘤细胞黏附等[4]。肿瘤细胞在此过程中破坏基底膜并降解细胞外基质(ECM)，从而实现肿瘤的侵袭和转移[5-6]。基质金属蛋白酶3(MMP3)是ECM合成和调节降解代谢平衡过程中存在的关键性酶之一，与肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关[7-8]。目前关于MMP3在NSCLC中作用的研究甚少，其在NSCLC中的功能尚未阐明。本研究旨在探讨MMP3在NSCLC的表达及其可能的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2011年1月至2016年12月中国人民解放军联勤保障部队第904医院NSCLC患者手术切除的肿瘤标本76份(NSCLC组)及癌旁正常组织76份(癌旁对照组)。经两位有经验的病理医师确诊为NSCLC，其中男47例，女29例；年龄25～76岁，平均(60.00±12.70)岁；肿瘤直径小于或等于3 cm者27例，>3 cm者49例；低分化者25例，中分化者49例；高分化者2例；按AJCC第七版临床分期分为Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期35例；伴有淋巴结转移者42例，无淋巴结转移者34例。随访主要采用门诊复查及电话回访等形式，随访时间1～91个月，失访者随访时间按照截尾数据处理。患者术前均未接受任何辅助治疗。

1.2 方法

1.2.1主要试剂

sc-21732 MMP3抗体购自美国Santa Cruz生物科技公司。

1.2.2IHC检测和结果判读

IHC采用Envision两步法，MMP3鼠抗人单克隆抗体工作浓度为1∶100。由两位病理医师对切片进行盲式阅片，从染色细胞的比例(<5%为0分，5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分)及染色的深度(无染色为0分，弱染色为1分，中度染色为2分，强染色为3分)来评定每一个肿瘤组织切片MMP3表达水平。两项评分相乘得到综合评分，并分为4个等级：阴性(-，0～1分)，弱阳性(+，>1～4分)，中度阳性(++，>4～8分)，强阳性(+++，>8分)。

1.2.3基因表达综合(GEO)数据库分析

从开放的GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载NSCLC患者mRNA表达谱的数据集GSE18842、GSE19804和GSE31552，分别包括45例肿瘤样本和46例癌旁样本、60例肿瘤样本和60例癌旁样本、62例肿瘤样本和63例癌旁样本。分析MMP3 mRNA在NSCLC和癌旁组织中的表达变化。

1.2.4基因表达谱动态分析(GEPIA)数据库分析

GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)是一个用于分析癌症基因组图谱(TCGA)数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)中肿瘤和正常样本RNA表达数据的网站。GEPIA被用来对NSCLC中的MMP3进行生存分析。根据中值将基因表达分层为高表达和低表达，用对数秩检验确定MMP3表达对NSCLC生存的意义。

1.3 统计学处理

数据使用SPSS22.0软件进行统计学分析。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher概率法。以Kaplan-Meier法建立生存分析模型，组间比较采用Log-rank检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组标本组织中MMP3表达水平比较

MMP3表达主要定位于细胞质或细胞膜。NSCLC组中MMP3的阳性表达率为80.26%，其中弱阳性10份(13.16%)，中度阳性32份(42.11%)，强阳性19份(25.00%)。癌旁对照组中MMP3的阳性表达率为59.21%，明显低于NSCLC组(χ2=7.980，P=0.008)，见图1、表1。

A：NSCLC组织；B：癌旁组织。

表1 两组标本组织中MMP3表达水平比较[n(%),n=76]

2.2 两组标本组织中MMP3 mRNA表达水平比较

利用GEO数据库分析了3组不同数据集(GSE18842、GSE19804和GSE31552)NSCLC组织和癌旁组织中MMP3 mRNA的表达情况，结果显示，MMP3 mRNA在NSCLC组织中的表达水平均明显高于癌旁组织(P<0.05)，见图2。

2.3 MMP3表达与NSCLC临床病理的相关性分析

MMP3在NSCLC中的表达与肿瘤直径、淋巴结转移和临床分期明显相关(χ2=4.887、6.182、5.106，P<0.05)，而与患者的性别、年龄及肿瘤的病理分级无关(χ2=0.573、0.267、1.408，P>0.05)，见表2。

图2 MMP3 mRNA在两组标本组织中的表达

表2 MMP3表达与NSCLC患者临床病理特征的相关性分析[n(%)]

2.4 MMP3 表达与NSCLC患者预后的相关性分析

利用Kaplan-Meier生存分析MMP3表达与NSCLC患者预后的关系，结果显示，与MMP3阴性组相比，MMP3阳性组患者的总生存率明显降低(P<0.05)，见图3。利用GEPIA数据对MMP3 mRNA表达与NSCLC患者预后的分析结果显示，MMP3 mRNA高表达的患者总生存时间明显低于MMP3 mRNA低表达的患者(P<0.05)，见图4。

图3 MMP3表达水平与NSCLC患者预后的关系

图4 MMP3 mRNA表达与NSCLC患者预后的关系

3 讨 论

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，分别占全球男性和女性新发恶性肿瘤的第一位和第二位，其发病率和病死率一直居高不下。据统计，全球每年约有160万新发肺癌患者[9-11]。因此，肺癌严重威胁着人类的健康。近年来，虽然对肺癌的诊断和治疗都取得了一定的进展，但是，由于肺癌的发生、发展和转移的过程非常复杂，有诸多基因和蛋白参与调控，因此，肺癌恶性进展和转移的具体机制尚未阐明。

组织的ECM和基底膜是阻止肿瘤入侵和转移的天然屏障。ECM的退化和基底膜完整性的丧失会导致肿瘤的侵袭和转移。MMPs是关键的蛋白分解酶，能够通过降解ECM和基底膜促进癌细胞侵入周围组织，与恶性肿瘤的浸润和转移密切相关[12]。MMP3是MMPs超家族的主要成员之一，主要由结缔间质细胞、成纤维细胞、毛细血管内皮细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞产生，能降解基底膜、蛋白多糖、层黏连蛋白、纤维蛋白和Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原蛋白等多种蛋白多糖或糖蛋白[13-14]。MMP3能通过剪切基质分子核心蛋白聚糖来释放转化生长因子β1(TGF-β1)，释放的TGF-β1对肿瘤细胞的增殖、侵袭转移、分化及免疫功能都具有重要的调控作用，从而产生广泛的生物学效应。与其他MMPs不同，MMP3主要的功能是激活其他类型的MMPs，如MMP2和MMP9[15-16]。

对胃癌、乳腺癌、胰腺癌等肿瘤的研究结果表明，MMP3在乳腺癌、胰腺癌和胃癌中高表达，且其表达可以作为预测肿瘤患者生存时间的生物标志物[8,17]。既往研究发现，肿瘤中的MMP3水平与MMP9活性密切相关，脂肪细胞外泌体上的MMP3能够激活MMP9的活性，并促进恶性肿瘤的侵袭和转移[18]。本研究结果表明，与癌旁组织相比，MMP3 mRNA和蛋白在NSCLC中的表达明显升高，且NSCLC中MMP3表达与肿瘤直径、淋巴结转移和临床分期呈明显的正相关性。此外，IHC检测结果显示，MMP3阳性的NSCLC患者总生存率明显低于MMP3阴性的患者。来源于TCGA的数据也表明，MMP3 mRNA高表达的患者总生存时间明显低于MMP3 mRNA低表达的患者。以上的结果表明，MMP3与NSCLC的发生、发展、分化程度、转移及预后密切相关。检测NSCLC组织中MMP3的表达，在预测NSCLC的发展、转移和复发风险等具有重要的临床意义。因此，MMP3有望成为NSCLC治疗的潜在靶标。

综上所述，NSCLC组织中MMP3表达上调与NSCLC患者的预后以及多个临床特征如肿瘤直径、淋巴结转移和临床分期密切相关，可能促进NSCLC的恶性进展和转移，其表达水平可能作为NSCLC预后预测的重要指标。然而，关于MMP3在NSCLC中具体的生物学机制尚不清楚，有待于进一步研究。