七氟醚麻醉对胃癌大鼠认知功能的影响及机制研究

程亮亮，田 毅，黄运伯,魏 晓

(中南大学湘雅医学院附属海口医院麻醉科，海口 570208)

现阶段，胃癌已逐渐成为严重威胁人们生命健康的重要疾病之一。中国胃癌患病率占全球胃癌发病的42.6%，病死率占45.0%，为癌症防治重点[1]。胃癌根治性手术仍为胃癌治疗首选方法，可为下一步综合治疗提供依据和时间[2]。但多数胃癌患者易出现术后认知功能障碍(POCD)，临床表现包括注意力减退、记忆力减退、社交能力下降等，多发于术后48 h内，部分患者症状可持续7 d至数月。POCD一直是影响胃癌患者术后康复效果的关键，且临床尚无防治POCD发生的特别有效的措施。近年来，吸入型麻醉药物在POCD发生中的作用，逐渐引起较多学者关注，其中七氟醚备受关注，主要是因其虽具有起效快、麻醉效果强、可减少围术期血流动力学波动等特点，但对术后认知功能影响尚不明确。NELLORE等[3]认为，七氟醚可引发生理应激反应，影响认知功能，但这一影响是暂时性的。李繁等[4]经动物实验发现，七氟醚可能通过诱导中枢神经系统炎性反应、氧化应激反应等，引发大鼠认知损伤。另外，神经细胞凋亡可受氧化应激反应、炎性反应影响，进而诱导神经细胞功能退化，引发POCD[5]。但目前临床就七氟醚吸入麻醉是否参与胃癌患者POCD发生发展过程尚无明确定论。因此，本研究创建胃癌大鼠模型，重点分析七氟醚麻醉对POCD的影响，以探寻有效的麻醉方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

选取50只健康雄性SD大鼠[湖南省实验动物中心，许可证号：SCXK(湘)2016-0001]，体重250～300 g，8周龄，在22～25 ℃、清洁环境中适应性喂养3 d，每日光照及黑暗时间各12 h。动物处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》[6]。本实验已通过该院伦理委员会审核。

1.1.2仪器与试剂

SSC600沉降离心机(张家港市远华机械制造厂)，JP-420电热恒温干燥箱(武汉市武昌实验仪器厂)，-80 ℃冰箱(美国Thermo scientific公司)，4 ℃冰箱(德国西门子股份公司)，ZH00 65型Morris水迷宫系统(成都泰盟软件有限公司)，GDS800凝胶图像分析软件(美国UVP公司)，七氟醚(批号：20000102，日本Mukhi公司)，二氨基联苯胺(DAB)液(美国Sigma公司)，羊抗兔IgG抗体(美国Santa Cruz公司)，戊巴比妥钠(美国Epitomics公司)，肌氨酸乙酯亚硝胺(NSEE)、亚硝酸钠致癌剂(美国Sigma公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛、淀粉样前体蛋白(APP)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海泸尚生物科技有限公司)，兔抗大鼠胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、半胱氨酸天冬氨酸酶-9(caspase-9)单抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1动物模型建立及分组

50只大鼠按照体重分组法分为A、B、C、D、E 5组，每组10只。除A组外，其余4组参照文献[7]采用NSEE(2.00 g/kg)和亚硝酸钠(0.30 g/kg)混合灌胃，建立胃癌大鼠模型，每天1次，持续3个月。各试验结束后，行病理组织学鉴定，经手术取胃小弯体-窦交界处胃黏膜，光镜下检查，观察存在胃黏膜肠上皮化生病变，即为建模成功。40只大鼠建模成功33只(82.50%)，剔除未建模成功大鼠后，B、C、D、E组分别有8、8、9、8只大鼠纳入研究。A组以等量生理盐水灌胃，持续3个月，10只大鼠均纳入研究。

1.2.2手术及麻醉

建模成功后2周。A组给予生理盐水腹腔注射；B组以100 mg/kg丙泊酚腹腔注射麻醉诱导，C、D、E组分别以1%、2%、3%七氟醚吸入麻醉诱导，均行腹部探查术，手术时间为2 h，术中常规吸氧，术后给予头孢曲松钠腹腔注射预防感染。七氟醚吸入载体为纯氧，吸氧流量为2 L/min。

1.2.3Morris水迷宫测试

术后第7天开始，各组大鼠均行水迷宫测试。每天晚21:00开始，持续5 d。第1～4 天实施定位航行实验，第5天实施空间探索实验，维持水温(24±2)℃。(1)定位航行实验：大鼠面朝池壁推入水中，头保持同侧，观察并记录其寻找平台时间，计算逃避潜伏期(入水至找到隐藏在水面下平台的时间)、目标象限游泳距离(大鼠在目标象限内的游泳距离)，以评估认知功能中学习能力。针对超过2 min未找到平台者，逃避潜伏期按照2 min计算。(2)空间探索实验：完成定位航行实验24 h后，保持参数不变，平台撤去。入水点为第1象限，大鼠推入水内，观察并记录其2 min内运动轨迹、穿越平台次数，以评估认知功能中记忆能力。

1.2.4海马组织标本采集

水迷宫测试完成后，各组大鼠以40 mg/kg注射6%戊巴比妥钠麻醉，断头处死。冰袋上覆盖无菌锡箔纸，快速分离大鼠海马组织，液氮冷冻存24 h后，置于-80 ℃冰箱内冷冻保存。

1.2.5ELISA检测海马内SOD、丙二醛、APP水平

海马组织按照2.50 mL/g脑质量，加入相当体积生理盐水，匀浆器研磨，超声波粉碎制备匀浆。4 ℃条件下，12 000 r/min，离心10 min，离心半径8 cm，取上清液。严格按照试剂盒使用说明书检测SOD、丙二醛、APP。标准品、稀释样品置于反应孔，封板胶纸密封，轻轻摇晃，置于37 ℃孵育箱，持续孵育60 min。洗涤各孔，干燥，重复5次。滴入AB显色液，避光，置于37 ℃孵育箱，观察10 min显色完成后，加入终止液，反应5 min。10 min内观察并读取吸光度(A)值。以A值为纵坐标，以标准液浓度为横坐标，创建浓度标准曲线，按照A值获得样品浓度。

1.2.6Western blot法检测海马组织GFAP、TNF-α、caspase-9表达

海马组织按照1∶10 g/L比例加入蛋白提取试剂，匀浆器研磨，超声波粉碎制备匀浆。4 ℃条件下，离心半径10 cm，12 500 r/min，离心15 min，取上清液。采用BCA法进行蛋白定量，按照目的蛋白相对分子量实施十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，蛋白质转膜。封闭溶液为5%脱脂牛奶，37 ℃条件下，轻摇2 h，分别加入GFAP、TNF-α、caspase-9进行杂交反应。4 ℃，轻摇，过夜。磷酸盐缓冲液(PBS)洗膜，每次5 min，共3次。滴加羊抗兔IgG抗体，进行杂交反应。37 ℃条件下孵育，共1.50 h。PBS洗膜，每次5 min，共3次。发光剂显影，X射线胶片曝光，GDS800凝胶图像分析系统行半定量分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠水迷宫测试结果比较

定位航行实验第1天时，5组大鼠组间逃避潜伏期、目标象限游泳距离比较，差异无统计学意义(P>0.05)。定位航行实验第4天时，各组间逃避潜伏期、目标象限游泳距离比较，差异有统计学意义(P<0.05)；5组大鼠逃避潜伏期、目标象限游泳距离均短于第1天(P<0.05)；A、B、C、D、E组大鼠组间逃避潜伏期、目标象限游泳距离逐渐延长(P<0.05)。空间探索实验中，A、B、C、D、E组大鼠组间穿越平台次数逐渐减少(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠水迷宫测试结果比较

2.2 各组大鼠海马内SOD、丙二醛、APP水平比较

A、B、C、D、E组大鼠组间SOD水平呈逐渐下降趋势，丙二醛、APP水平呈逐渐增高趋势，各组大鼠组间SOD、丙二醛、APP水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 各组大鼠海马内GFAP、TNF-α表达水平比较

Western blot法检测结果显示，A、B、C、D、E组大鼠组间GFAP、TNF-α相对表达水平呈逐渐增高趋势，各组大鼠组间GFAP、TNF-α相对表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.4 各组大鼠海马组织caspase-9表达水平比较

Western blot法检测结果显示，A、B、C、D、E组大鼠组间caspase-9相对表达水平逐渐增高，各组间caspase-9相对表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

表2 各组大鼠海马内SOD、丙二醛、APP水平比较

a：P<0.05，与A组比较；b：P<0.05，与B组比较；c：P<0.05，与C组比较；d：P<0.05，与D组比较。

a：P<0.05，与A组比较；b：P<0.05，与B组比较；c：P<0.05，与C组比较；d：P<0.05，与D组比较。

3 讨 论

POCD在重大手术患者中较常见，与高龄、手术时间长、炎性反应、高血压、心理因素等有关[8-10]。胃癌患者出现POCD，可引发记忆力受损、认知功能低等，严重影响术后生存质量。近年来，随着对POCD研究的不断深入，认为麻醉药物选择可能是影响POCD发生的重要因素。七氟醚在多种疾病全身麻醉诱导及麻醉维持中发挥重要作用，具有麻醉作用强、起效快、对气道刺激小等特点。但目前临床就胃癌大鼠中七氟醚麻醉对认知功能影响分析仍较少，尚未达成一致意见。有研究认为，1.3%七氟醚预处理对局灶性脑缺血大鼠具有脑保护作用[11]。但也有研究提出，七氟醚吸入麻醉是引发大鼠认知功能损伤的一个重要因素[12]。因此，进一步分析七氟醚对认知功能影响，明确其与POCD发生的关系，以指导临床合理应用，具有重要意义。

本研究结果显示，水迷宫测试中定位航行实验第4天时，各组大鼠逃避潜伏期、目标象限游泳距离均较第1天时减少，这提示随着水迷宫训练时间延长，可提升大鼠学习、记忆能力。杨宁等[13]研究中提出，丙泊酚连续麻醉，可经由对海马区自噬进行抑制，引发老年大鼠空间学习记忆能力损伤。本研究中，B组第4天时逃避潜伏期、目标象限游泳距离上较A组稍增加，穿越平台次数较A组稍减少，与前述结果相符。ZHAO等[14]认为七氟醚麻醉会给发育中大鼠学习、记忆能力造成影响。本研究结果显示，各组第4天时逃避潜伏期、目标象限游泳距离明显延长，穿越平台次数明显减少，且C、D、E组逃避潜伏期、目标象限游泳距离随吸入七氟醚浓度提升而变化，这也说明七氟醚麻醉可能会给大鼠认知学习能力造成一定影响，且随吸入浓度增加，影响越明显。

炎性应激反应在POCD中发挥重要作用。SOD能对生物体新陈代谢过程中形成的有害物质进行清除，且在清除氧自由基中作用明显。丙二醛是反映机体脂质过氧化、细胞损伤程度的重要指标，可参与脂质过氧化发生、发展。APP是一种常见急性反应蛋白，易被分解产生β-淀粉样蛋白，激活星形胶质细胞，引发氧化应激、炎性反应，是POCD重要病理学过程[15-16]。本研究中，C、D、E组丙二醛、APP水平较A、B组升高，SOD水平降低，说明七氟醚麻醉可引发应激反应，且随七氟醚吸入浓度增加，应激反应越明显，可能与七氟醚提升APP表达引发氧化应激反应有关。

本研究还发现，各组大鼠海马组织GFAP、TNF-α表达水平也存在差异，与A、B组比较，C、D、E组的GFAP、TNF-α表达升高，说明七氟醚麻醉还可诱导炎性反应，且作用呈浓度依赖性。有研究发现，七氟烷有细胞毒性作用，可引发细胞凋亡或损伤，产生POCD[17]。炎性反应与细胞凋亡之间有密切关系，细胞凋亡参与组织内炎性细胞数量调节，而炎性细胞浸润可诱导细胞凋亡[18]。caspase家族蛋白酶可调控细胞凋亡，其中caspase-9为细胞凋亡起始因子，可在其他蛋白影响下出现自我活化现象，且可激活下游caspase-3，促进细胞凋亡[19-20]。本研究中，C、D、E组caspase-9表达较A、B组高，七氟醚在诱发炎性应激反应同时，也增加了caspase-9表达，且作用呈浓度依赖性，提示七氟醚可能经由诱导炎性应激反应，改变caspase-9表达，促进细胞凋亡，引发POCD；且随七氟醚吸入浓度增加，对认知功能影响越明显。本研究结果显示，虽然七氟醚麻醉可影响胃癌大鼠认知功能，但1%七氟醚麻醉对学习、记忆能力及细胞凋亡的影响较2%、3%七氟醚浓度小，故临床可按照胃癌患者实际情况合理应用。

综上所述，七氟醚麻醉可能通过诱导应激反应、炎性反应及促进细胞凋亡，参与胃癌大鼠POCD发生、发展过程，且吸入浓度越高对POCD影响越明显，故临床可在保证麻醉效果同时，选择较小剂量应用。本研究局限在于经动物复制的疾病模型与人体自然条件下出现的疾病可能存在一定差异，无法完全等同，故仅可为七氟醚麻醉在胃癌患者中应用研究提供理论参考。