长链非编码RNA 与心血管疾病关系研究进展

闫 丽， 葛智儒

（1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.上海市浦东新区公利医院心血管内科，上海 200135）

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA），在转录和转录后调节以及染色质修饰中发挥着关键作用。许多研究发现lncRNA 与心肌损伤及心血管疾病有关联，表明lncRNA 对心血管疾病的发生、发展具有重要意义。本文综述了循环lncRNA 生物学特性以及lncRNA 与动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭、心脏肥大、高血压、心律失常等心血管疾病关系的研究进展。

1 lncRNA 的发现、分类和作用机制

基因组研究发现，只有不到2%的哺乳动物基因被翻译成蛋白质，其他大部分是无编码功能的非编码RNA（ncRNA）。先前ncRNA 被视为遗传转录中的一种“垃圾”，是不具有功能的[1-2]，随着研究的深入，发现tRNA 和rRNA 参与了基因的表达，小核RNA（snRNA）作为结构非编码RNA共同存在。近年来，微小RNA（miRNA）、环状RNA（circRNA）、小干扰RNA（siRNA）以及lncRNA 逐渐进入人们的视线，并发现它们在细胞中具有重要的调节作用[3]。其中lncRNA 具有比蛋白质基因组更强的调控能力和组织特异性，是ncRNA 的最主要组成部分[4]。

lncRNA 为转录本大于200 个核苷酸的非编码RNA，和信使RNA（mRNAs）一样，它们通常经RNA 聚合酶Ⅱ转录，进一步剪接和聚腺苷酸化，但它们没有或具有很低的编码能力。依据lncRNA在基因序列相较mRNA 的所在位置，目前被分为以下六类：（1）基因间，lncRNA 是位于两个氨基酸编码基因序列基因组间隔内的转录本；（2）内含子lncRNA，是从氨基酸编码基因序列的内含子转录而来；（3）双向lncRNA，是位于紧邻蛋白编码基因的相反链中，靠近启动子区域1 kb的基因组内；（4）增强子lncRNA，通常位于小于2 kb 增强子区域内；（5）正义lncRNA，位于编码基因的同一链上，重合一个或多个内含子和外显子；（6）反义lncRNA，位于编码序列基因的反向链上，重合一个或者多个内含子和外显子[5]。虽然一些lncRNA 被证明进化是保守的，但与蛋白质编码转录本相比，大量lncRNA 并不表现出相同水平的保守约束[6]。许多lncRNA 位于合成基因组区域，以细胞类型特定的方式显示物种之间的保守表达模式，因为它们的调节元件和启动元件相似[7-8]。lncRNA 具备种群特异性，且细胞之间的特异性强，由于lncRNA 有着相对较长的碱基序列，可以完成多种RNA-RNA 交互作用和构成繁杂的三维空间形态，其独特的物理构型使lncRNA 可以与靶基因建立核结构域并结合蛋白质形成RNA-DNA-蛋白质复合物[9]；开放的单链RNA 序列使得lncRNA 可以通过与其他碱基序列相结合发挥其基本功能[10]。因此，lncRNA 可以通过多元化的机制来减弱或触发基因的转录调控。

lncRNA 通过与蛋白质的相互作用形成蛋白质复合物，根据它们的细胞定位可以作为染色质修饰剂，修饰染色质的特定位点[11]；作为信号分子，调节细胞过程，从染色质中分离蛋白质的分子装饰[12]。核内lncRNA 还参与调控染色质，通过直接与基因组DNA 相互作用，将表观遗传修饰因子招募到特定位点[13]，还有一些lncRNA 结合相邻基因组位点启动基因组印迹[14]。经直接RNA交互作用，lncRNA 通过调节蛋白质的稳定性[15]、翻译[16]和剪接[17]来调节蛋白质的转录。通过间接调节转录水平的方法，lncRNA 还被证明能将miRNAs 从内源性靶点中分离出来，并充当分子海绵[18]。lncRNA 还可以转录后调节其靶基因，间接地充当miRNA 的前体，既可调控其靶基因lncRNAs，也可以编码短肽[19]。综上，lncRNA 主要存在于细胞核中，可以与多种核内的蛋白发挥协同作用，在表观遗传方向调节基因序列的表达。存在于胞质中的lncRNA 能调节蛋白质导向、mRNA 稳定性和翻译。虽然具有活性细胞表达的lncRNA 的列表正在稳步增长，但人们对功能性lncRNA 的理解仍然非常有限。

2 心脏特异性lncRNA 的生物学功能

利用大规模的转录组测序技术（RNA-Seq），在心脏发育过程以及成年后健康心脏和心肌梗死、压力超负荷等模型，对心血管系统内多种类型的细胞进行基因表达谱分析，已经找到数千种心脏特异性lncRNA，并且发现心脏特异性lncRNA 在胚胎期与成年心脏的相对表达差异较大，而在成年心脏与疾病模型之间差异很小，表明心脏特异性lncRNA 在心脏发育中具有关键作用。心脏发育涉及多类细胞同时分化的生物过程，基因序列表达的精密时间和空间调节参与其中[20-21]。在心脏发育过程中起关键作用的lncRNA包括Bvht（Braveheart）、Fendrr（Fetal-lethal noncoding development regulatory RNA） 和Kcnqlot1等[22-24]。了解心血管lncRNA 在发育和疾病过程中的生理作用，并弄清它们的调控功能是顺式还是反式机制运行，通常需要对lncRNA 表达进行实验性调节。

2.1 Kcnqlot1 与心脏发育

Kcnq1 是一个编码K+通道的基因，它最初是印迹基因，但在心脏发育过程中成为双链等位基因，而lncRNA Kcnqlot1 是Kcnq1 基因的内含子11 向反义方向转录形成的。2012 年9 月，Korostowski 等[22]提出，特别是在心脏中，Kcnqlot1 也可转换为双等位基因表达，并且与Kcnq1 表达具有相同的时间窗；进一步研究表明，在心脏发育早期，Kcnq1 印迹基因水平不依赖Kcnqlot1 的转录，而在心脏发育的后期，存在明显的相关性。并且Kcnqlot1 具有调节Kcnq1 的表达作用，在胚胎期16.5 d，K-小鼠的Kcnq1 水平明显高于野生型小鼠。此外，他们还发现Kcnq1 水平的增加伴随着一个异常的三维染色质结构。他们的研究显示，Kcnqlot1 经过修饰染色质可变性和调控增强子，从而调节Kcnq1 的相对表达量。

2.2 Bvht 与心脏发育

麻省理工学院的Klattenhoff 等[12]发现，在小鼠的18 号染色体上具有小鼠特异性lncRNAAK143260，简称Bvht，对心脏发育至关重要。Bvht开始在小鼠的胚胎干细胞发育阶段的早期表达，成年的心脏中相对表达量也很高。他们发现，小鼠胚胎干细胞中Bvht 的耗竭会导致跳动的心肌细胞丢失，并导致心脏转录因子系统激活失败，其中包括Nkx2.5 和Mesp1（心血管祖细胞的一个标记物，它决定了心脏所有细胞的最终类型）。通过转录组学分析，认为Bvht 在心源性Mesp1 的上游起作用，以诱导其表达并指导心脏基因调控系统的正确激活。他们还观察到Bvht和SUZ12（多梳抑制复合物的组成部分）互相作用，进而促进组蛋白H3 赖氨酸27 甲基化，并且参与调控心脏的表观遗传。此外，Bvht 耗竭的新生儿心肌细胞表现出异常的肌原纤维，a-肌球蛋白和b-肌球蛋白重链表达降低[12]。

2.3 Fendrr 与心脏发育

在Bvht 发现不久，Grote 等[23]报道了另一种中胚层中富集的长2 397 bp 的lncRNA-Fendrr，对于小鼠心脏和体表的发育极其重要。Fendrr 是从基因Foxf1 分化转录而来，该基因在外侧板中胚层特异性表达，产生心脏和体壁肌。他们发现，小鼠Fendrr 的缺失导致心脏和体壁的发育受损，引起心肌功能障碍，最终使得E13.75 左右胚胎致死率升高。还发现小鼠体内Fendrr 的缺失，增加了胚胎初期E8.5 的Nkx2.5 和Gata6（心脏发育的转录序列）的相对含量。与Bvht 类似，Fendrr表观遗传调控心脏发育的一些转录因子，包括GATA-6、NKX2-5、FOXF1、TBX3、IRX3 和PITX2。然而，Fendrr 的丢失增加了Nkx2.5 和Gata6 启动子上H3K4me3 的甲基化状态，而使得靶基因表达降低。他们的研究结果表明，Fendrr 与Bvht 类似，通过表观遗传调控心脏转录因子的表达，对心脏发育起到至关重要的作用。

3 循环lncRNA 与心血管疾病

循环lncRNA 作为心脏生物标记物的研究进展较缓慢，lncRNA 在体液中不稳定，大多数lncRNA在神经母细胞瘤细胞系中是稳定的，所以lncRNA为心血管疾病的发生和转归中的表观遗传学研究提供了极为有益的方法。

3.1 lncRNA 与动脉粥样硬化

炎症是生命体抵抗外伤和受到感染时的一种自身的防御反应。动脉粥样硬化病变是很多心脑血管疾病的基础，是一个繁杂的慢性炎症过程[24]。近期有几项研究显示，lncRNA 在动脉粥样硬化发生过程中起关键作用。

3.1.1 Ang362 已知血管平滑肌细胞（VSMC）的增长在动脉粥样硬化的发展中具有不可或缺的作用。最近的研究[25]显示，lncRNA 与miRNA 之间的正向调控和VSMCs 的增殖及肥大有关，从而促进动脉粥样硬化。并发现lncRNA-Ang362 与miR-221/222 相近，且和VSMCs 中的miR-221/222 共同转录。通过AngⅡ治疗，循环中Ang362和miR-221/222 以时间依赖的方式增加。Ang362的下调降低了miR-221/222 和McM7（与DNA 复制的开始和细胞周期有关）的表达，并且还阻碍VSMCs 的增生。虽然目前仍然不清楚McM7 究竟是不是miR-211/222 的可能靶标，但lncRNAAng362 通过正调控McM7 和miR-221/222.3，从而使得AngⅡ引起的血管功能障碍加剧，进而促进动脉粥样硬化的形成[25]。

3.1.2 ANRIL（anti-sense noncoding RNA in the INK4 locus） 2013 年2 月日本大阪大学的Congrains 等[26]研究称，用小干扰RNA 敲低主动脉VSMC 中的ANRIL（由染色体9p21 位点编码的lncRNA）会降低细胞增殖，并且小干扰RNA 特异敲除相异的ANRIL 外显子1 和19，致使机体动脉粥样硬化有关通路基因表达的发生明显改变。2013 年7 月Holdt 等[27]报道，ANRIL 的过表达可增加细胞黏附，促进细胞增殖和减少细胞凋亡，这些都是动脉粥样硬化发展的重要机制，进一步研究发现，ANRIL 特异基因序列的启动子结构区富含Alu 基因序列，这对于转录调控和促动脉粥样硬化机制至关重要。这些研究证明ANRIL 与动脉粥样硬化发展及严重程度显著相关。

3.1.3 RP5-833A20.1 lncRNA RP5-833A20.1存在于核因子IA（NFIA）基因序列的内含子2中，转录方向与NFIA 相反。lncRNA RP5-833A20.1负向调节NFIA 的mRNA 和蛋白含量，而NFIA是miR-382-5p 的靶点，NFIA 蛋白表达含量降低的是由RP5-833A20.1 的过表达引起的，加重了THP-1 巨噬细胞的炎性反应和脂质积累，而hsamiR-382-5p 抑制剂完全可以延缓脂质沉积和炎性反应[28]。然而，miR-382-5p 和RP5-833A20.1之间存在的基因相关性仍然很少被探索，仍需更进一步破解。

3.2 lncRNA 与心肌梗死（MI）

MI 是多见的致命性心血管疾病，虽然近年来取得了一些进展，但MI 的分子机制实质上依旧没有完全阐明。目前已经证实，miRNA 参与MI的发生和发展，并基于miRNA 的治疗方法可能会发挥作用[29]，但lncRNA 在MI 发生中的主要作用研究很少。一些单核苷酸多肽（SNP）分析表明lncRNA 与MI 之间具有关联性。

3.2.1 MIAT（MI-associated transcript） 2006 年10 月，日本的Ishii 等[30]在MIAT 中发现了6 个SNP。他们首先明确了急性心肌梗死易感位点位于染色体22q12.1 染色体上，并在该位点上发现了新基因，即MIAT。紧接着，他们发现MIAT 由5个外显子组成，进一步实验证明其未编码任何产物。此外，体外功能分析显示外显子A11741G 中有一个SNP 比正常的等位基因增加了MIAT 的转录水平，而其他5 个SNP 没有显示出转录差异。他们分析认为，SNP 改变了MIAT 的表达或许与MI 的病发机制相关。

3.2.2 KCNQ1OT1 2014 年9 月，Vausort M 等[31]发现，MI 患者的外周血与身心健康志愿者的外周血相比较，lncRNA 缺氧诱导因子1A 反义RNA 2，成员1 相反链/反义转录本1（KCNQ1OT1）和与转移相关的肺腺癌转录本1 的水平较高。与非ST 段抬高MI 患者相比，ST 段抬高MI 患者的ANRIL，KCNQ1OT1，MIAT 和转移相关的肺腺癌转录本1 水平较低。

3.3 lncRNA 与心力衰竭（HF）

HF 是各种心脏结构或者功能性疾病致使心室充盈或射血能力损坏的一种综合征，是许多心血管疾病的危重和终末阶段，多并发于心肌梗死、心肌病和心肌炎等。虽然在诊疗水平上不断提高，但HF 迄今依然是一个严重的卫生保健难题。虽然在蛋白质介导的转录调节和信号通路取得显著进步，但仍然未能实现对该疾病关键诊疗的突破。近年来，大量lncRNA 的检测结果以及ncRNA 参与基因表达中多种调控作用可能会提供一些线索[32]。

3.3.1 NRF（Necrosis-related factor） Wang 等[33]在建立小鼠缺血再灌注模型中发现一种lncRNA，即NRF，它是一种与细胞质中的miR-873 互相作用的内源性lncRNA。研究[32]发现，NRF 的敲除可以增加miR-873 的表达，降低miR-873 的下游目标RIPK3 和RIPK1 的表达水平（PIPK1 和RIPK3 参与H2O2诱导的小鼠心肌细胞坏死），使得心肌坏死急剧减少。他们发现，NRF 能够在转录水平实行调控，在NRF 的启动子区检测到p53的结合部位。H2O2增加了NRF 启动子同p53 的关联，芯片检测进一步表明p53 增加了NRF的活性，从而影响下游因子。功能测定表明，敲除p53可减少细胞坏死，抑制NRF 启动子在H2O2上的活性。miR-873 的表达增加，RIPK1/RIPK3 的水平降低，也是由下调的P53 水平引起的。这些结果阐明了心肌细胞坏死过程中lnc RNA-miRNAmRNA 轴的调控关系，为探讨心肌功能障碍的潜在治疗靶点提供依据。

3.3.2 LIPCAR LIPCAR 是线粒体来源的长链非编码RNA，LIPCAR 有可能参与介导线粒体通路，如氧化磷酸化。线粒体功能紊乱导致多种心血管疾病的发生，特别是冠状动脉粥样硬化型心脏病和心力衰竭的发生。2014 年Kumarswamy研究团队发现[34]，血浆中LIPCAR 与心肌梗死后左心室重构程度呈显著正相关。随后，该研究团队还发现，血浆中LIPCAR 水平在慢性心衰和心梗后1 年慢性心力衰竭患者血浆中表达量增加，可以预示心衰患者的存活率。初步发现LIPCAR与左心室舒张功能的下降和心室重塑的发生有关，但LIPCAR 广泛临床的运用意义以及作用功能仍需全面的探究。

3.4 lncRNA 与心律失常

心律失常，尤其是恶性心律失常，与心血管疾病的患病率和病死率有关。遗传因素与心律失常的发生和进展有关，其中包括神经代谢、Ca2+调控的功能障碍以及心脏结构和电通路重塑[35]。因此，将要被发现的标志性的心律失常诊疗和转归的靶向标记物对控制这种情况和防治心脏猝死具有重大的意义。

研究[36]发现，lncRNA 可以通过调节不同的mRNAs 来影响心房颤动（atrial fibrination AF）的进展，lncRNA-AK055347 经过调控MSS51、Cyp450和ATP 合成酶，从而促进AF 的发病。上调miR-208b 可抑制心房重构过程中SERCA2、CACNB2和CACNA1C 的表达和功能。lncRNA 经过miRNA及其特定的mRNA 相互作用，致使AF 发展中的电重塑。于TCON_00075467 基因的敲除组5 只兔中，有3 只兔诱导房颤，而且沉默TCON_00075467可明显减短原发性心房肌细胞的L 型钙电流（ICaL）、有效不应期（AERP）和动作电位（APD），揭示了抑制TCON_00075467 含量与房颤的产生存在关系[35]。

3.5 lncRNA 与心脏肥大

持续的心脏肥大常伴有适应不良的心脏重塑，导致顺应性下降并使得心衰风险增加。适应不良的心脏肥大被看作与HF 患者的发展有关。2014 年2 月，中国动物学研究所的Wang 等[37]研究表明，lncRNA CHRF（心脏肥大相关因子）参与AngⅡ靶向基因miR-489 诱导心脏肥大的病理过程，CHRF 通过充当miR-489 的内源性海绵来降低miR-489 的水平。

3.6 lncRNA 与扩张型心肌病

扩张型心肌病是以心室的扩大及收缩功能受损为特点的心脏疾病，常致充血性心力衰竭的发生。遗传在扩张型心肌病的病变中具有重要作用。2009 年Friedrichs 等[38]确定了一个基因组区域（5q31.2～3），该区域具有白种人发生扩张型心肌病的风险等位基因，类固醇受体RNA 激活物（SRA）基因同时产生类固醇受体RNA 激活蛋白和几个非编码SRA 转录本。将该区域的SRA1敲除可以引起斑马鱼心室收缩功能障碍，揭示SRA1 与扩张型心肌病的关系。

3.7 lncRNA 与高血压

高血压是最多见的心血管疾病之一，然而高血压发生、发展的分子机制仍然未能全部阐释。氧自由基被指出与血管内皮功能和妊娠期高血压相关[39]。近期一些研究[40]表明，lncRNA 在高血压发生发展中起到一定的作用，发现MALAT1 可以调控血管生长和内皮细胞功能，SENCR 被认为是一类新型血管细胞富集的lncRNA，与平滑肌细胞表型有关[41]。另外的研究[42]发现，在Dahl 盐敏感型的大鼠与原发性高血压大鼠间发现了749 个相异表达的lncRNA。然而，lncRNA 对高血压影响的研究只是起步阶段。

3.8 lncRNA 与动脉瘤

动脉瘤的特点是血管壁变薄和血管病理性增宽，常发生在大动脉，破裂后可导致死亡。microRNA 参与动脉瘤形成[43]，但lncRNA 与动脉瘤的关系研究处于初步阶段。有报道[44-45]显示，全基因相关研究确定ANRIL 存在与腹主动脉瘤有关的遗传易感染性的基因位点。Foroud 等[46]通过基因组关联研究证实了ANRIL 可以作为颅内动脉瘤风险因子。然而，ANRIL 在动脉瘤中的作用功能仍然不明确，需要通过更多功能实验加以验证。

4 总结和展望

lncRNA 的基本功能是近些年来生命科学及医学科学研究关注的领域，发展非常迅速。识别特异的lncRNA，针对疾病的诊断治疗极其重要。迄今已经发现多种lncRNA 与心力衰竭、冠心病、心肌梗死及心律失常等心血管疾病的生理以及病理生理过程相关。尽管目前的研究仅阐明了少数lncRNA 的作用机制，而lncRNA 却能以多种方式参与心血管疾病的发生发展。可以预测，通过进一步系统全面的研究，愈来愈多的lncRNA会被发现，阐明lncRNA 繁杂的调节机制和功能靶标将会为心血管疾病的临床诊疗提供最新的手段。