表面等离激元共振成像技术在血型检测中的研究进展*

吴晓聪，何建安，伍昌林，李华文，顾大勇

(1.广东医科大学公共卫生学院，广东东莞523808；2.深圳国际旅行卫生保健中心，广东深圳518033；3.深圳市检验检疫科学研究院，广东深圳518010；4.深圳大学第一附属医院 深圳市第二人民医院 a.输血科，b.检验科，广东深圳518035)

输血成功依赖于准确可靠的血液分型方法。目前有39个公认的血型系统，血型抗原超过300个，最广为人知的血型系统是ABO和RhD系统。这300多个血型抗原中许多具有重大临床意义，如果分型不正确会导致免疫介导的溶血性输血反应(hemolytic transfusion reaction，HTR)。血清学法、微柱凝胶卡法和PCR-序列特异性引物(sequence specific primer，SSP)等技术检测血型，或需要标记，或检测周期长、检测通量低，容易造成假阳性或假阴性。表面等离激元共振(surface plasmon resonance，SPR)技术被公认为是“最好的无标记生物检测方法”。表面等离激元共振成像(surface plasmon resonance imaging，SPRi)技术与蛋白质芯片技术结合，可以发挥二者的优点，是一种全新的、精准的检测血型的免疫学诊断技术。

1 常用血型检测方法

1.1免疫学法 玻片凝集法、试管凝集法、微量平板凝集法和凝胶柱凝集法[1-3]鉴定血型在检测过程中容易受多种因素影响，结果判读极易出错，其操作难以实现规范化。目前，流行的量化方法是通过视觉对抗原抗体结合强度进行初步分类，但由技术人员进行分析量化的方法是主观的、经验的、欠敏感的，且通过简单的视觉分析来辨识弱交互作用通常很难。荧光辅助细胞分选技术(FACS)和流式细胞术(FCM)是2种可以定量分析红细胞抗原与其相应抗体相互作用的方法。但是这2种方法都需要双键和单键交替的分子结构产生共轭效应来激发荧光效果，会影响抗原抗体结合的活性。FACS使用带有标记的抗体，这种抗体发出明亮的荧光，可在特定波长下用光学显微镜观察。同样，FCM依赖于附在血细胞上的荧光标记抗体，测量细胞通过激光时发出的光[4-5]。这些方法通常用于量化红细胞表面表达的抗原位点的数量，并具有动力学分析能力。然而，由于抗体抗原复合物在用FACS或者FCM检测荧光之前发生反应，这2种方法都受到时间延迟分析的影响。因此，实时测量抗原抗体相互作用分析有限。

1.2基因分型检测 目前使用的ABO血型基因分型技术可以分为2大类：检测单核苷酸多态性(SNP)和检测核苷酸序列。检测SNP的技术包括：用SSP扩增SNP片段的PCR-SSP技术，通过PCR扩增产物与序列特异性寡核苷酸探针(sequence specific oligonucleotide probes，SSOP)杂交来鉴定相应SNP片段的PCR-SSOP技术[6]。PCR-SSP和PCR-SSOP技术只能检测出已知的SNP，因此可能漏检未知的基因突变，这是该技术的先天性缺陷。此外，除非鉴定全部数以百计的已知SNP，否则可能得到错误的基因分型结果。在以PCR为基础的测序分型技术(sequence based typing，SBT)中，PCR扩增产物一般含有2条单体型DNA，观察到的测序图是2条单体型核苷酸序列的加合，因此可能产生模棱两可的分型结果。

分子克隆技术是将ABO血型基因克隆到载体后再测序，这样每个克隆只含有1条单体型的基因片段，不存在模棱两可的测序结果，但是整个过程比较费时费力，因此一般只用于验证新发现的等位基因。

众所周知，检测出某个基因或其mRNA不能作为该基因所编码的蛋白质得到表达的直接指标。基因分型预测的血型表型，最终必须用血清学方法验证，以避免潜在的定型错误。虽然血型基因分型技术已广泛应用于ABO血型基因分型，但是由于产生ABO亚型分子机制的多样性，基因分型预测ABO亚型尚有一定的局限性。

1.3新型传感器 SPR生物传感器主要由光学检测系统、传感芯片、液流控制系统、温控系统和计算机软件5部分元件组成。其中，传感芯片是最核心的组件，传感芯片提供了产生SPR信号的必需物理条件，且分子相互作用在传感芯片表面进行[7]。根据光学反射率变化的原理，SPR生物传感器中生物分子在金(Au)表面吸附，导致活性金表面附近折射率发生变化，根据折射率的信号变化观察生物分子的相互作用，通过监测结合和解离过程中光学性质的变化来研究分析动力学、亲和力和浓度的定性及定量信息[8-9]。大多数细胞不适用于商用SPR仪器的微流控系统，而红细胞具有高度变形性，适用于微流控系统。SPR技术可针对血液免疫学检测需求，将具有高灵敏度优点的SPRi技术与微流控芯片技术集成，发展成为满足临床需求的血液免疫分析仪。

2 SPR在血型鉴定中的应用研究

2.1ABO+RhD血型鉴定 血型鉴定可利用SPR技术在传感器表面固定相应的血型抗原或抗体进行检测。Quinn等[10]首次报道了SPR在血型抗原和抗体中的应用，利用相应的血型IgM抗体修饰SPR传感器表面，实现对红细胞表面A、B抗原的检测。虽然该方法对A、B抗原均有较好的选择性，但由于不能完全解离结合材料或部分功能化表面被祛除导致表面再生能力较差。近年来，人们对SPR技术应用于血型检测进行了大量研究，使传感器表面再生得到了改善，并且增加了测量周期的次数，提高了该方法的可行性。Hungkamang等[11]使用微阵列传感器芯片固定抗A和抗B，观察抗体阵列与红细胞表面A、B抗原之间的相互作用来对ABO血型进行鉴定。他们使用SPRi进行多重分析，降低了检测成本、检测时间和样品消耗。将SPR应用于血液分型中，还需要充分了解抗原抗体凝集强度的附加信息。依据粘附强度和壁面剪应力(WSS)，粘附的红细胞在剪切流条件下会以不同的细胞平均速度(Vc)被迫离开感兴趣区域。根据红细胞膜上携带的抗原与抗体的相互作用对细胞运动的抵抗力，细胞平均速度(Vc)越高，凝集强度越低，相应的抗原-抗体结合程度越低，否则相反。根据SPR信号随时间的变化来计算Vc的凝集强度，可用于不同凝集素的定量分析[11]。Sudprasert等[12]利用固定化抗A、抗B抗体阵列与红细胞膜表面抗原的相互作用，获得了红细胞与固定化抗体的凝集强度，其凝集强度与抗原-抗体相互作用的量或红细胞粘附强度相对应。Tangkawsakul等[13]利用抗A和抗B共价固定在由高折射率玻璃、Cytop膜层和金薄膜(Au)组成的LR-SPR生物传感器芯片上来大量检测分析物质，即红细胞。研究表明，LR-SPR芯片与常规短程SPR传感器相比，灵敏度更高、表面再生效果更佳。结合微阵列技术，SPRi技术可发展成为高通量和多重分析的有效工具。

在验血的时候，抗体有2种类型：(1)五聚IgM，(2)单抗IgG。根据血凝原理，红细胞表面抗原与血型特异性IgM抗体发生结合，便于红细胞凝集和阳性鉴定。但是与IgM抗体不同的是，IgG抗体与红细胞结合时不出现凝集，需要使用额外的凝集试剂抗人IgG做阳性指示，即用IgG抗体对阳性红细胞进行致敏化，抗人IgG就能检测到致敏红细胞上的球蛋白分子Fc片段，从而检测抗原是否存在，这被称为间接抗球蛋白试验(IAT)[5]。Krupin等[14]使用了长程表面等离子体激元波导，通过固定的抗A IgG抗体捕获红细胞上血型抗原A，检测红细胞表面抗原A和B。该系统允许在极低的细胞浓度样品中捕获红细胞，捕获检测浓度远远低于观察到的最低血细胞比容水平的浓度。Li等[15]构建了在玻璃衬底上沉积纳米金(GNPs)表面固定抗A和抗B的光学生物传感器，该传感器进一步集成到含有2个独立样本细胞的微流控芯片中，与紫外可见光谱仪相结合，分别用于A、B、AB和O型血液的鉴定，建立了一种简便、快速、可靠的ABO血型分型和红细胞计数检测方法。该方法用于血液分型具有较高的准确性，用于红细胞计数具有较高的敏感性。与传统方法相比，该传感器能够同时进行血型分型和红细胞计数，有利于快速评价贫血[16-17]。与普通凝胶微柱测定相比，该测定方法更灵敏，需要的血液样品较少、时间更短。因此，该检测平台有潜力对血型系统进行定性和定量检测，修饰其他常见红细胞表面抗原的抗体，如Rh因子。此外，该传感器有望实现全自动，从而达到省时、避免人为误差的目的。

为了实现高效的基于SPR血液分型，需要一种更快速、更方便的抗体定向固定方法。经典的右旋糖酐-水凝胶偶联方法具有非特异性结合低、结合能力高、化学稳定性强等优点。然而，这种方法既繁琐又耗时(2～3 d)，还需要技能熟练的操作员。而且固定的方法导致随机抗体固定，因为空间位阻可能会影响抗体与抗原的结合能力。Zhou等[18]提出了一种新的方法来量化ABO血型，开发了一种基于波长干涉的SPRi传感器，采用抗体结合蛋白修饰的SPR芯片直接固定血型抗体，形成检测线阵列，当血样与抗A和抗B相互作用时，通过共振倾角的变化同时检测4个红细胞样本。血液分型结果与微柱凝胶试验结果一致，检测时间包括芯片修改时间均小于1 h。该方法对红细胞A和B的检测量最低为每毫升2×106个细胞，比传统的SPR血型传感器具有更高的灵敏度。在紧急和资源限制的情况下，这种技术在快速诊断、移动保健和公共卫生安全领域有着巨大的应用潜力。

Rh(D)抗原表型除了正常的D阳性和阴性表型外，还有多种D变异表型，如弱D、部分D和DEL型。Then 等[19]以D抗原为例探讨了一种用通用的抗人IgG抗体来检测红细胞抗原的方法。该方法借鉴了间接抗球蛋白试验(IAT)，使用抗人IgG抗体与致敏红细胞量化出红细胞与抗体(IgG)之间的相互作用，从而进行血型分型检测。该检测表面可完全再生，在进行100多次再生过程中，功能化表面几乎没有降解。他们也探讨了SPR定量检测血液中的弱抗原和部分抗原的潜力和敏感性[20]。该敏感性研究将抗人IgG抗体固定在金传感器表面，然后使用SPR检测两种临床上重要类型的弱D变体：弱D和部分D。相较于以往的研究，利用SPR实现了两类弱D变体的检测，提高了灵敏度，为血型抗体-抗原相互作用的识别、定量和分类开辟了巨大的新前景。

2.2Rh抗原及Duffy抗原检测 Rh 血型系统是目前被国际输血协会(ISBT)确认的30多个红细胞血型系统中最具复杂性和多态性的血型系统，在临床输血中其重要性仅次于 ABO 血型。Rh血型抗原除了D抗原具有很强的免疫原性外，C、c、E 和e抗原在输血过程中也会引起溶血性输血反应以及新生儿溶血症。Rh系统主要多态性为C/c、E/e。因此，设计抗C，抗c，抗E，抗e的单克隆抗体，可以构建SPR检测芯片来分析Rh血型抗原表型种类进行血型检测。Szittner等[21]展示了一个和临床相关的血型抗体(A，B和Rh血型)组成的SPR阵列，只需少量的血液样品处理，每个血样本能够在5 min内进行快速的血型表型分析，这为大量供输血的样本处理提供一种可行的替代经典血型分型的方法。对照现有实验室诊断的标准技术，在cspri-rbc芯片上配备8种主要血型抗体中的7种(A、B、D、C、c、E和K)，可对随机供体样本进行重复分型，并且其分型以及再生能力都非常强，特异性抗体分型的数量至少可以增加到96种，还有至少可以对100个样本进行分型。除抗E/e单克隆抗体以及抗体特异性低会导致结果不一致外，所有抗体的分型结果与经典血清学结果完全一致。该研究表明SPRi的传感器表面可以固定多种RBC抗体，并且重复多次使用还能获得所有样本可靠的分型。但由于Rh血型系统抗原类型与A和B抗原在RBC上位置的差异，Rh抗原需要更长的温育时间来与固定的抗体反应，并且停止流动试验可以促进Rh抗原、跨膜蛋白和固定抗体之间的相互作用，而连续流动不能应用于检测分析。Pipatpanukul等[22]证实了这项技术的适用性，即AB和Rh血型特异性抗体可直接固定在传感器羟甲基葡聚糖(CMD)改性的金表面上进行红细胞表面抗原的检测。该研究通过固相固定试验同时识别抗原，显示了检测Rh稀有血型系统的潜力，减少了手工操作的时间，简化分析，提高了成本效率。

众所周知，Duffy系统抗体-抗原之间的相互作用在血液系统中是比较弱的，与RhD血型相比，Duffy血型表达的抗原相对较少，并且具有完全不同的结构。目前定量检测Fya和Fyb抗原的方法并不十分敏感，这在分析弱的Fya和Fyb抗原抗体相互作用时受到了严重的限制。Then等[23]以Duffy血型(Fya和Fyb)作为模型探讨了SPR技术在血液分型中检测弱抗原抗体相互作用的价值，研究了一种抗人IgG Fc功能化传感器表面来检测Duffy抗原弱的相互作用。该研究表明抗体浓度的最低阈值是成功检测的必要条件。在孵育阶段使用浓缩的抗Fya和抗Fyb液，部分检测成功。但是这些结果并不完全可复制，随着时间的推移，Duffy抗原-抗体复合物发生了显著的离解，而且影响SPR检测Duffy抗原的因素有多种，包括抗体浓度、抗原表达和抗原结构。这些弱、不稳定和可逆的抗体-抗原相互作用限制了SPR检测的准确性和重复性。尽管存在这些障碍，但使用SPR技术成功检测了阳性Duffy抗原。RBC结合检测的实例表明，一旦能形成更强、更稳定的抗原-抗体复合物，就可以进行SPR分析和检测。

2.3血小板抗体的筛查 输注血小板可预防和治疗血小板减少或血小板功能缺陷引起的出血，但是患者多次输血后，容易产生血小板相关抗体，导致血小板输注无效(PTR)[24]。血小板特异性抗体的检测对血小板免疫性疾病的诊断具有重要意义。目前，血小板抗体检测和鉴定的方法，主要是固相凝集法、单克隆抗体特异性血小板抗原固定术(MAIPA)和FCM等。MAIPA、固相凝集法的指示红细胞的保存期短，易造成试剂浪费等；免疫法易出现假阴性或假阳性，该方法进行临床检测时需要较多混合的O型血小板，但血小板表面抗原的复杂性，抗原谱不明确，易造成抗体的漏检。因此，需要进一步改进研究或采用新的检测方法。Metzner等[25]报道了一种新开发的、易于操作的血小板抗体珠阵列(PABA)，用于检测血小板特异性抗体的性能。PABA是一种将MACE技术与珠阵列技术相结合的检测人血小板抗体的可靠的多重检测平台。该平台将促进实际鉴定血小板特异性抗体的常规检测。伍昌林等[26]初步应用SPR的非标记技术在血小板抗体的筛选与配型中，他们采用氨基耦联法在SPR传感芯片表面固定相应的通用型血小板抗原，实现了对相应血小板抗体的检测。但是，SPR技术是使用血小板谱抗原作为点样抗原，由于抗原谱的复杂性，可能存在抗原谱不全面，从而出现血小板稀有抗体漏检的问题。随着基因组学与蛋白组学的发展，血小板抗原的全面检测，该问题将会解决。随着SPR技术进一步发展成熟，临床应用将更加简便，可以直接筛查血小板抗体，通过配合试验，选择与受血者相合的血小板显得更加容易，该技术将有望应用于临床日常检测工作中。

3 总结与展望

SPR是一种无标记的实时跟踪分子相互作用的方法，利用固定在传感器表面上的IgM或抗人IgG的特异性红细胞抗体或血小板血型抗原来实现基于SPR的血液分型与鉴定，所述抗体或者抗原又用作捕获血液分析物的配体，通过SPRi技术监测微流控室中结合的分析物实现对ABO和RhD血型鉴定，Rh抗原及Duffy抗原检测以及血小板抗体的筛查，从而进行血型鉴定以及分型，并且可以循环再生使用。新型号的SPR生物传感器还可以实现自动化，可以同时分析多个样本，为定量的、多抗原的血液分型平台提供了条件。不过SPR生物传感器在定量分析研究中仍存在一些问题。目前大部分基于SPR生物传感器的检测方法都依赖于大型仪器，成本高昂，主要用于实验室研究。许多检测场合，如果取样后送回实验室分析，将降低检测的速度和准确性。因此，需要开发更便于携带的SPR生物传感器，以推广SPR技术在生活中的应用。近年来，已有多个实验室开展了便携式SPR生物传感器的研究[27-28]，随着研究不断深入，SPR技术在生活中的应用将会越来越广，随着科技的不断发展与创新，该技术可结合其他技术，在临床医学检测中达到更好的效果，解决更多的医学难题，具有非常可观的发展前景。