高通量测序技术在确认病原微生物中存在的问题与挑战*

赵建玉，周倩倩，鲁辛辛，胡继红

(1.首都医科大学附属北京同仁医院检验科，北京100730；2.北京医院 国家老年医学中心 国家卫生健康委临床检验中心，北京100730)

1998年首次提出宏基因组的概念[1]，2000年，宏基因组学的应用从环境拓展到临床。宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)技术通量高，一次能对几十万到几百万条核酸序列测序，可无偏倚检测标本中所有的微生物种类，生物信息学分析后可从结果中获得与感染相关的病原微生物信息[2]。测序成本的指数级下降推动了mNGS技术的临床开展[3]。2019年底，mNGS对新型冠状病毒的快速确认在认知突发的疫情中发挥了重要作用。尽管传统病原学诊断技术不断发展，但仍有近50%的感染病原不明。mNGS测序技术为不明原因的疑难重症、新发、突发病原体的鉴定提供了新的选择，成为临床实验室的重要技术补充。虽然mNGS在感染性疾病的诊断中凸显出巨大优势与潜力，但该技术从研究走向临床仍面临诸多挑战。

1 mNGS的临床应用

1.1感染性疾病的诊断与鉴别诊断 传统微生物鉴定方法(培养、免疫学方法、PCR)一次只能检测一种或有限的病原微生物，mNGS针对临床标本中所有核酸物质，包括DNA和/或RNA，无偏倚检测病毒、细菌、真菌和寄生虫等[4]，主要用于中枢神经系统、呼吸系统和循环系统感染性疾病的诊断与鉴别诊断[5]。研究表明，mNGS可有效帮助临床医生排除活动性中枢神经系统感染[6]，快速鉴定出新型经蜱传播的Powassan病毒[7]，还可明确病原微生物与疾病之间的新型因果关系[8]，诊断结核性肝脓肿[9]及免疫缺陷患者的混合感染[10]等。此外，对测序数据进行二次分析还可获得系统发育谱系[11-12]、耐药性预测及确定耐药基因等遗传信息[13]。

1.2微生物种群与疾病的关系 利用mNGS对微生物种群及其可能参与的急慢性病进行研究，促进了益生菌的开发利用，可用于治疗艰难梭菌的感染[14]，并证明对孕期母体及胎儿有益[15]。同时，越来越多的研究显示微生物种群的组成与多种疾病相关，如克罗恩病[16]、结直肠癌[17]、2型糖尿病[18-19]、坏死性小肠结肠炎[20]、肥胖症[21]和孤独症[22]等。宏基因组学技术将成为研究微生物群落与人体健康关系的重要手段。

1.3转录组学分析的优势 RNA的表达通常与微生物转录活性有关，检测RNA可能有助于区分感染与定植[23]或病原微生物的存活与死亡[24]。分析人类宿主的转录组学可增强对宿主-微生物相互作用的认识，尤其在病原微生物短暂存在时，根据人类特异性宿主免疫反应间接诊断，可能会提高 “窗口期”检测的敏感性，如莱姆病[25]或某些虫媒病毒感染等。还可根据宿主RNA对活动性结核病作出预测[26]。疾病的诊断与鉴别诊断是特异性宿主转录组学分析的另一个发展方向，一项研究表明，同时评估呼吸道病原微生物、呼吸道微生物种群和宿主转录组可使下呼吸道感染的阴性预测值达到100%[23]。

2 确认病原微生物的问题与挑战

受测序灵敏度、取样及病程变化、实验室检测能力及生物信息学分析水平的影响，mNGS阳性或阴性结果不能作为临床诊疗决策的唯一依据，结果的准确性与标本处理、文库制备、上机测序及生信分析的任一个环节的质量控制密切相关。mNGS结果判读应结合临床与微生物专业知识。

2.1标本质量

2.1.1采样时机 通常认为症状超过1个月的亚急性和慢性感染者可在较长时间内获取含有微生物核酸的标本，如感染钩端螺旋体4个月[27]、患囊虫病1年[28]，mNGS检测仍可阳性。但急性感染病毒(如西尼罗河病毒)仅在发病的最初几小时或几天出现在脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)中[29]，错过急性期可能造成假阴性。此外，采样前使用抗菌药物也可造成假阴性。因此，应尽可能在急性期采集标本送检mNGS，若未能在急性期取得标本，应谨慎解释假阴性结果。

2.1.2标本采集 标本采集应无菌操作,防止污染造成假阳性结果，如腰椎穿刺获得的CSF标本、持针器肘静脉采集的血液标本可能会受到正常皮肤微生物的污染[30]，溶血性CSF使RNA病毒检测的敏感性降低[31]等。理想情况下，应优先选择经过验证的、不含DNA/RNA的采集容器。严格遵守标本采集原则对降低污染风险至关重要。

2.1.3转运和存储 标本的转运和存储同样会影响检测结果。血清或CSF标本在室温或4 ℃保存数天，RNA降解可使mNGS产生假阴性结果。金属离子螯合剂EDTA可抑制核酸酶和蛋白酶活性，使核酸稳定性增强，因此应尽量取新鲜标本立即送检，如需延迟处理，EDTA抗凝血液或血浆比血清更可取[32]。

老年重症肺炎（CAP）是引起老年患者呼吸衰竭的主要原因之一[1]，目前，临床上主要采取机械通气（MV）等方法支持呼吸。MV是抢救呼吸衰竭患者的重要手段，能够维持患者的SPO2水平。但治疗期间容易引起肺实质感染性炎症，即呼吸机相关性肺炎（VAP）[2]。VAP是一种严重的院内感染，主要发生于机械通气治疗2 d 后及停机拨管后2 d内，不仅会加重患者病情，同时还会严重威胁患者生命安全。有报道称，积极、有效的护理干预能够提升CAP并发VAP患者的治疗效果，改善其预后。因此，本文对老年CAP并发VAP患者加强护理干预，并观察其对患者治疗效果的影响，现报道如下。

2.2核酸含量及质量

2.2.1核酸含量 mNGS是一种直接核酸检测方法，通过回收基因组DNA或RNA鉴定病原微生物。如果标本中不包含病原微生物核酸或核酸含量较低，则可产生假阴性结果，如局限性脑脓肿、一过性感染或低滴度(<100个拷贝)感染等。急性传染病精确诊断(The Precision Diagnosis of Acute Infectious Diseases，PDAID)的一项研究表明，与传统检测方法相比，58例明确诊断为神经系统感染的患者中有26例(45%)mNGS检测结果为假阴性，其中11例通过血清学诊断(如西尼罗河病毒)，7例为局限性脑脓肿，6例序列数低于报告阈值，2例未检测到病原微生物核酸[11]。

2.2.2核酸提取方法 mNGS技术的准确性依赖于不同类别微生物核酸的提取效率。不同微生物细胞壁组成不同，核酸提取效率不同，如真菌、分枝杆菌细胞壁较厚，若不使用特殊的破壁处理方法，较低的核酸提取效率会产生假阴性结果。

2.2.3人源核酸去除与富集 低丰度病原微生物须进行核酸富集或宿主核酸去除，去除效率过低或过高均可能降低检测灵敏度，产生假阴性结果。目前，已开发出多种制备RNA文库的人源核酸的去除方法，如利用DNase Ⅰ去除人源DNA[33]，抗人源线粒体和核糖体RNA抗体可去除标本中50%～80%的人源核酸[34]，但当病原微生物核酸含量极低时作用甚微，额外添加试剂还可能增加外源背景污染[35]，尚无针对DNA文库的有效去除与富集办法。市售的DNA富集试剂盒富集效率有限，如NEBNext微生物DNA富集试剂盒(美国纽英伦生物技术公司)和MolYsis Basic试剂盒(德国Molzym公司)[33]。另外，有研究表明利用非离子表面活性剂预处理标本，可使人源细胞裂解而保留和富集具有细胞壁的微生物(如细菌和真菌)，然后用DNase Ⅰ降解背景DNA，可使微生物核酸达到1 000倍以上富集[33]。但无细胞壁的病原微生物(如支原体或寄生虫)可能也会在预处理阶段被去除，造成假阴性结果。因此，去除人源核酸的方法选择需结合临床检测目的。

2.3测序方案

2.3.1测序策略 mNGS测序策略包括DNA和/或RNA测序，不同测序策略会影响某些病原微生物检测结果的准确性。在拟诊基础上，深入了解各种测序策略适应症对临床医生选择合适的检测项目具有重要意义。DNA测序可检测除RNA病毒以外的病原微生物，RNA测序除可检测RNA病毒、反映病原微生物转录活性外，还可对转录组学及宿主特异性免疫反应作进一步分析。因此，若临床已排除病毒感染，可直接进行DNA测序。当怀疑病毒感染，尤其是呼吸道、血液、CSF标本，或临床表现复杂、无特定怀疑方向时，应同时进行DNA和RNA测序。如果仅进行DNA测序可能会造成假阴性。

2.4生物信息学分析

2.4.1序列质量 一次高通量测序可产生数千万条短序列，得到下机数据后，首先应进行质量评估以保证序列可用性。评估指标包括Q20占比、接头污染比例、有效序列长度及数据的有效比对率等。如果下机序列未进行质量评估，测序接头、低质量序列(如Q20质量碱基比例少于30%的序列)、低复杂度序列及重复序列未能有效去除，将无法保障作为微生物鉴定的输入序列的质量，无法保证结果准确性。

2.4.2人源序列 mNGS检测灵敏度与下机数据中人源序列含量有关。标本类型不同，人源序列占下机总序列的比例不同，如脑膜炎患者CSF中97%～99%的序列可能是人源序列[23]。如果宿主产生较强的免疫反应，标本中白细胞升高，病原微生物的相对序列数将进一步降低。生物信息分析时若能有效去除人源序列，将提高微生物检测的分析灵敏度。这就要求用于人源序列比对的数据库尽可能完整，应至少包括人基因组、转录组、线粒体、核糖体等序列。如果人源数据库不完整，人源序列去除不充分，将对后续微生物序列的比对与分析产生较大干扰。

2.4.3微生物数据库 多数测序公司选择NCBI数据库进行微生物序列比对，该数据库包含来自全球所有已知生物的基因组序列，数据库庞大，部分基因组草图或序列包含错误信息，可能会使标本的低质量读数(即计算噪声)与错误注释的序列或数据库条目中的污染序列相匹配而导致假阳性结果。与NCBI比对的序列，如有必要需进行二次验证。高精度的数据库(如FDA Reference Viral Database，RVDB[38])包含已知病原微生物的高质量基因组信息，可减少微生物匹配错误的可能性，但未包含在该数据库中的病原微生物可能会因匹配不到而产生假阴性。应鼓励有实力的实验室根据我国感染性疾病特点自建数据库。

2.4.4污染菌 对过滤后的数据进行微生物鉴定，首先应确定致病菌(一种或多种)与污染物(如皮肤正常菌群或实验室与试剂中的污染物)的比例。有研究表明，在常用的DNA提取试剂及其他试剂中，外源DNA普遍存在，严重影响结果判读，特别是微生物含量低的标本[39]。为最大限度减少低水平微生物污染导致的假阳性结果，可建立检测阈值标准，如CSF中某些代表性微生物的检出下限为0.16 CFU/mL，若病原微生物丰度低于检测限将产生假阴性结果[31]。生物信息分析应结合临床，否则可能会漏掉或错报重要病原微生物。

2.5标准化

2.5.1缺乏参考标准及质控品 大多数可用的标准品都是针对特定应用高度定制的，如Zymo BIOMICS微生物种群标准品(ZymoBIOMICS Microbial Community Standard)，主要用于微生物种群及细菌和真菌宏基因组学分析[38]。美国国家标准与技术研究所(the National Institute of Standards and Technology，NIST)的标准品只包含细菌。当前，实验室多自建质控品，利用“无模板”(即无菌水)或标本采集过程中的皮肤正常微生物菌群、试剂及实验室中的污染菌等构建背景污染菌模型。但由于缺乏通用的参考标准和质控品，无法确保mNGS分析的质量及稳定性，无法比较不同实验室间的检测性能。

2.5.2缺乏标准化的工作流程 目前，尚无针对mNGS的标准化程序，尚无 FDA批准的用于感染性疾病诊断的mNGS方法。各实验室工作流程高度个性化[40]，从样品制备、试剂选择、测序过程到最终的生物信息分析管道等关键的工作流程不尽相同，缺乏标准化和方法验证，无法评估不同实验室结果，无法保证测序的准确性。

2.6确认实验 由于不同类型微生物基因组长度和测序平台存在差异，无法针对所有微生物建立统一的阴阳性判读标准[41]，临床应对mNGS的结果持谨慎态度。mNGS阳性不一定是病原体阳性，需要第二种方法或标志物验证；如是病原体阳性，也不一定都是致病菌，必须结合临床进行解释，必要时可与微生物学和分子生物学等专家共同研讨。在临床标本中发现非典型或新型病原微生物时应进行确认实验，如正交试验、血清学及特异性核酸扩增等，如有必要还应进行细胞培养或动物模型试验加以验证。

2.7其他挑战 尽管宏基因组学快速发展，但在临床实验室开展该技术仍然问题诸多。高成本、非医保仍是开展mNGS的主要障碍。实验室面临的主要问题是缺少临床应用及标准化操作的专家共识或指南、缺乏通用参考标准及验证方法、缺乏规范化的检测体系及全过程质量控制；绝大多数提供报告的检测实验室无资质，未认可；针对检测到的微生物，无法明确是致病菌、定植菌还是污染菌；新的研究成果如何实时转变为临床所用等。

3 展望

3.1推动mNGS在临床实验室的认证 国外一家临床微生物实验室已成功开发并验证了一种用于神经系统感染性疾病的mNGS检测方法，可从CSF中全面检测与脑膜炎和脑炎相关的病原微生物，并获得了临床实验室改进法案修正案(Clinical Laboratory Improvement Amendments，CLIA)认证[42]。此实验室正在对检测其他标本及感染类型的mNGS进行临床性能验证，这将推动mNGS的临床实施并为其他实验室提供参考。在未来，随着参考品和质控品的研发、共识及指南的出现以及更多标准化mNGS平台的建立，不同实验室间的评估及验证将得以实现，测序结果将更加精准。

3.2方法学优化 试剂盒及环境中的污染物不易去除，准确识别污染物对于mNGS结果解释至关重要，已有研究通过检测质控品鉴别出试剂和实验室环境中的常见污染菌并提出了相关指南[35]。以此建立基准数据库，如脑膜炎和眼内炎的常见污染微生物数据库[43-44]，有利于消除正常微生物种群和环境污染物的干扰并提高结果的准确性[45]。另外，有一些研究开发统计模型确定mNGS产生数据的优先次序，对鉴定的微生物进行排序，简化结果判读(例如Z分数算法)[45-46]。

3.3软硬件创新 新一代测序仪(如Illumina NovaSeq仪器)的输出量大大提高。机器人批量处理标本将显著提高实验室自动化程度。微流控设备(如VolTRAX116)将使mNGS在床旁检验(point-of-care testing,POCT)领域得以开发利用[47]。无需PCR即可测定无限长度的核酸序列的第三代单分子测序技术，可直接检测到甲基化，同步表观遗传学分析等[48]。此外，编程人员正在不断开发、验证和维护供临床使用的生物信息学管道，软件开发人员不断更新生物信息学分析的各种算法。文库制备方法、序列生成和生物信息学方面的技术进步正以更低的成本实现更快、更全面的宏基因组分析，相信在临床实验室专家、医生、制造商、平台和软件开发人员、生物信息学家及统计学家等多学科的深入合作下，mNGS应用之路会越走越远[49]。

4 小结

mNGS除用于感染性疾病的诊断外，还可用于种群分析、转录组学分析等，但在其他领域的应用依旧缓慢，多数尚未纳入常规临床实践。尽管mNGS仍不可能取代传统方法，但在某些情况下mNGS作为一种补充技术必不可少。随着测序技术的快速发展，预测几年内mNGS的检测速度和准确性将得到显著提高。总之，mNGS技术不断发展成熟，有望成为一种快速、可靠的病原微生物鉴定手段，并在不久的将来广泛应用于临床。