低DCAD对经EDTA诱导的低血钙山羊的钙调因子水平及瘤胃发酵的影响

■马政发 杨春红 许 可 吴文旋,2* 吴佳海

（1.贵州大学动物科学学院，高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，动物营养与饲料科学研究所，贵州贵阳 550025；2.贵州大学新农村发展研究院，贵州省山地畜禽养殖污染控制与资源化技术工程实验室，贵州贵阳 550025；3.贵州省畜牧兽医研究所，贵州贵阳 550006）

低血钙症临床表现为血钙浓度低于8 mg/dL，是常发生在围产期乳畜的营养代谢性疾病，低血钙容易诱发酮病、乳房炎、产后瘫痪等多种疾病，影响围产乳畜的生长健康和生产性能。实际生产中防治低血钙的方法，如围产前期补充维生素D 和甲状旁腺激素、产犊时使用CaCl2等补钙制剂或产前饲喂低钙饲粮等，存在诸多困难而不再使用。饲粮阴阳离子差（di⁃etary cation-anion difference, DCAD）具有操作简单和实用性强的优点，是当前生产中防治低血钙最有效的措施。DCAD 是指每千克饲粮干物质中主要阳离子（Na+、K+）和阴离子（Cl-、S2-）之间毫摩尔数的差值，低DCAD 可诱导机体酸化产生酸中毒，促进骨钙动员、小肠钙吸收以及肾钙重吸收，有效维持体内血钙稳恒，提高血钙浓度。

乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）是一种络合剂，能与Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+等金属离子结合而消除相应离子的功效。EDTA 可被研究用于矿物质代谢来诱导低血钙状态，从而建立试验动物生理和体液的生物模型。研究指出，通过静脉注射Na2EDTA 可成功诱发低血钙。以上研究为将EDTA 和低DCAD 联合使用提高血钙水平防治低血钙提供了有益的借鉴，但目前鲜见相关研究报道。据此，本试验通过在饲粮中添加EDTA人工降低血钙含量建立低血钙模型后，再饲喂低DCAD 饲粮，研究血钙水平恢复、钙调蛋白因子以及瘤胃发酵参数的效应。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选用年龄（2.5±0.2）年、体重（43.6±2.2）kg差异不显著的6 只黔北麻羊母羊（贵州地方品种山羊）为试验动物，随机分为两组：对照组和处理组，每组3个重复，每个重复1只羊，开展三个阶段的试验，每个阶段持续20 d。第一阶段为适应期，用于观察试羊健康状况，更换笼位、驱虫、消毒管理并观察试羊对饲粮的适应性。第二阶段为EDTA处理期，在试羊饲粮中添加2%的EDTA诱发低血钙。第三阶段为DCAD处理期，分别饲喂对照组（DCAD=203 mmol/kg DM）和处理组（DCAD=-170 mmol/kg DM）饲粮，然后采样。其中处理组饲粮在对照组的基础上添加45 g/d 的阴离子盐（MgSO4·7H2O+MgCl2·6H2O），3 个阶段试验羊饲粮结构一致，其饲粮组成及营养水平见表1。

表1 山羊饲粮组成及营养水平（干物质基础）

1.2 饲养管理

试验羊单笼舍饲，试验开始前驱虫，每天8：00、12：00、18：00饲喂3次，保证试羊自由采食、自由饮水。

1.3 指标检测

1.3.1 采食量

连续测定试验最后5 d 采食量。测定方法为：晨饲前清理食槽，准确记录饲喂量和次日剩料量，计算干物质采食量（DMI）。

1.3.2 尿液pH

自第三阶段开始，每天在试验羊采食2 h 后测定尿液pH，判断低DCAD 饲粮是否引起山羊体内酸化。检测方法：使用pH精密试纸（pH范围为5.4～7.0，6.4～8.0，上海试剂三厂）蘸取试验羊所排的新鲜尿液，在试纸显示颜色3 s后与精密比色卡比对观察。

1.3.3 血钙水平

血样采集分3步进行，用抗凝血管经颈静脉采血10 mL，4 000 r/min 离心15 min（80-2 型离心沉淀机；江苏中大仪器科技有限公司），收集血浆，用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定血浆中Ca2+水平。采样方法为，在第一阶段，连续3 d 采血检测，确保血浆Ca2+水平均处于正常范围内（8～12 mg/dL）；在第二阶段，EDTA 处理后，每3 d采血测定使其处于下降状态，直至发生低血钙（＜8 mg/dL）；在第三阶段，DCAD 处理后，每3 d 采血测定，直至血浆Ca2+含量最终正常。

1.3.4 血钙代谢因子

在第三阶段最后1 d，用抗凝血管经颈静脉采血10 mL，在4 000 r/min 条件下离心15 min（80-2 型离心沉淀机；江苏中大仪器科技有限公司），收集血浆，用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定血浆中甲状旁腺激素（parathyroid hormone, PTH）、瞬时受体电位通道香草酸受体6（transient receptor potential vanilloid receptor 6, TRPV6）、维生素D 受体（vitamin D receptor, VDR）、钠钙交换体1（Na+/Ca2+exchanger 1, NCX1）、细胞膜钙泵（plasma membrane Ca-ATPase 1b, PMCA1b）水平。

1.3.5 瘤胃发酵参数

第三阶段试验结束后，在晨饲前用瘤胃液采集器经口腔插入采集山羊的瘤胃液，测定瘤胃pH（FG2-ELK，梅特勒-托利多仪器），4 层纱布过滤后离心20 min（12 000 r/min），取上清液测定氨态氮（ammonia nitrogen, NH3-N）、挥发性脂肪酸（volatile fatty acid, VFA）。其中NH3-N 浓度参照王加启的方法测定；VFA 参照尹召华等的方法测定，利用气相色谱仪（GC-9A，日本岛津）进行测定。

1.4 数据分析

采用SAS 9.2 统计软件中独立样本t检验进行分析，试验结果以“平均值（Mean）±标准差（SD）”表示，P＜0.05表示差异显著性。

2 结果与分析

2.1 低DCAD饲粮对山羊DMI的影响（见表2）

表2 低DCAD饲粮对山羊DMI的影响

由表2 可知，处理组DMI 略低于对照组，两组差异不显著（P＞0.05）。

2.2 低DCAD饲粮对山羊尿液pH的影响（见表3）

表3 低DCAD饲粮对山羊尿液pH的影响

在第三阶段，对照组山羊尿液pH 在整个试验期均保持稳定，处于7.7～8.0 之间（pH=7.9±0.1）；处理组山羊采食低DCAD 水平饲粮后尿液pH 值下降（pH=6.5±0.7），显著低于对照组（P＜0.05）。

2.3 低DCAD 饲粮对山羊血浆钙及钙调节因子的影响（见表4）

表4 低DCAD饲粮对山羊血浆钙及钙调节因子的影响

由表4 可见，在第三阶段处理组血浆Ca2+、VDR、TRPV6 和PMCA1b 显著高于对照组（P＜0.05）。处理组PTH、NCX1 水平均略高于对照组，但无显著差异（P＞0.05）。

2.4 低DCAD饲粮对山羊瘤胃发酵的影响（见表5）

表5 低DCAD饲粮对山羊瘤胃发酵的影响

由表5 可知，与对照组相比，处理组丙酸浓度显著升高（P＜0.05）。两组其余指标（瘤胃pH、NH3-N 浓度、TVFA）差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 低DCAD饲粮对山羊干物质采食量的影响

干物质采食量（DMI）反映饲料适口性的好与坏，影响着动物的生长、泌乳及繁殖性能，许多研究均表明低DCAD 饲粮会引起动物DMI 下降。一方面是由于降低DCAD 水平所添加的阴离子盐带有苦涩味，会影响饲粮适口性，DMI 也随之降低。另一方面是因为低DCAD 会引起血液酸碱度和碳酸氢盐水平降低，减弱瘤胃的缓冲能力；同时胃肠道或中枢神经系统的感觉神经元中酸敏感离子通道可能会感应到低DCAD 的质子负荷变化，从而改变神经元的兴奋性状态，共同影响着动物的采食行为与食欲。本试验在DCAD 处理期开始时，也观察到DMI 下降的现象，但随着饲喂时间的延长，处理组山羊逐渐恢复正常采食，表明饲喂低DCAD 饲粮所导致的机体酸碱平衡状态改变并不是影响山羊DMI 的最主要因素，这得到朱伦琴等、于磊等研究结果的支持。同时本试验所饲喂的饲粮为颗粒饲料，一定程度上掩盖了阴离子盐的苦涩味，提高了饲粮的可食用性。结合前期研究结果，说明饲喂颗粒化饲粮可改善阴离子盐的适口性来防止DMI 的下降。

3.2 低DCAD饲粮对山羊尿液pH的影响

尿液pH 是评估阴离子盐饲粮引起机体代谢性酸中毒程度的关键指标，其变化范围可以衡量血钙水平的恒稳状态，常用来反映饲粮的DCAD 水平是否适宜。尿液pH 的改变是由于机体摄入阴离子Cl-、S2-后，导致Cl-、S2-在血液中的水平升高，为维持溶液的电中性，机体则通过增加尿液中的H+来排泄出多余的Cl-、S2-，最终尿液pH 呈现出降低的现象。一般而言，尿液pH 维持在5.5～6.8 比较合适，当尿液pH 低于5.5 时会引起机体过度酸化以及代谢性酸中毒作用的问题，对动物造成损伤的同时并没有额外的收益；然而当尿液pH 大于6.8时机体的酸化并不充分，PTH 对钙调因子的作用较弱，对改善血钙稳衡以及防治低血钙意义不大。本试验的尿液pH 受DCAD 的改变而下降，但仍处于合理范围之内（pH=6.5±0.7），充分表明DCAD 与尿液pH 之间存在很强的关联性，与相关研究结论类似。

3.3 低DCAD 饲粮对山羊血钙及其相关代谢指标的影响

钙是动物必需的重要元素，参与神经元活动、调节酶活、血液凝集、激素合成分泌等机体各种生理代谢过程。机体可通过胃肠道对钙吸收、骨钙溶解和肾重吸收钙来使血钙水平维持在一定范围内，静脉注射EDTA可以影响肠道和骨骼中钙的吸收以及免疫抑制的变化，在诱导低血钙症上已有许多研究。与其他研究不同的是，本试验采用直接饲喂EDTA的方式来与体内的钙络合达到降低血钙含量的目的，山羊血钙水平在进入第三阶段前已低于8 mg/dL，处于低血钙状态。此后饲喂对照组和处理组饲粮，处理组血钙水平显著高于对照组，结合处理组尿液pH 值显著降低，说明含阴离子盐的低DCAD 饲粮可诱发机体轻度代谢性酸中毒，促进饲料钙在小肠的吸收，同时还可以促进骨钙动员，进而加快血钙水平的恢复速度。Goff等前期研究结果也表明，饲喂低DCAD 饲粮可提高血钙水平。

骨钙溶解需以胃肠道钙吸收量不足为前提，才能释放骨钙进入血液，提高血钙水平。由于尿钙浓度很低，肾重吸收钙对维持血钙水平的贡献十分有限，不是提高血钙水平的主要因素。因此，增强胃肠道对钙的吸收能力是实现血钙水平提高的最佳方式。钙在胃肠道的吸收包括细胞旁路被动扩散入血和跨上皮细胞刷状缘部主动吸收两种方式，其中以主动跨膜吸收为主。Ca2+跨膜途径受多种因子的协同调控，吸收过程分3 步进行：①首先由位于细胞膜上对Ca2+有高度选择性的特异转运通道蛋白TRPV6 转导入胞；②在细胞内与钙结合蛋白结合转运至细胞基膜；③跨细胞膜排出入血，这一步骤由PMCA1b 和NCX1 发挥作用。此外PTH 能促进机体合成与分泌Ca2+转运介质1，25-二羟维生素D3[1，25-（OH）2VD3]，VDR 则通过与1，25-（OH）2VD3结合促进胃肠道上皮细胞形成钙结合蛋白，二者在Ca2+的吸收过程中也发挥着重要的作用。综合来看，PTH、VDR、TRPV6、PMCA1b、NCX1 等因子水平是影响胃肠道钙吸收效率的关键因素。前期报道发现，低DCAD 饲粮可提高PTH、TRPV6、VDR 的水平，这是因为低DCAD 破坏机体的酸碱平衡，代谢性酸中毒提高了组织对钙调节激素的响应能力，刺激甲状旁腺主细胞对PTH 的分泌，1，25-（OH）2VD3的合成也随之增加；同时它们的提高能激活磷脂肌醇信号系统（protein kinase system, PKC system）诱导β-葡萄糖苷酸酶的释放，进而刺激TRPV6 的生成。此外低DCAD 所诱导的酸化作用还会上调VDR mRNA 的表达，促进VDR 与1，25-（OH）2VD3相结合，增进钙的吸收。本试验与对照组相比，低DCAD饲粮组的PTH、VDR、TRPV6 都出现上升的趋势，其中VDR、TRPV6 达到显著差异水平，这与相关研究一致。在Ca2+吸收过程中，PMCA1b 依赖ATP 以电化学梯度的形式将Ca2+排出细胞外；而NCX1 转运蛋白则依靠介导Na+内流、Ca2+外排和作用相反的两种转运模式来调节细胞内Ca2+的水平。本试验结果显示，低DCAD 饲粮可提高PMCA1b 和NCX1 的水平，提高钙的吸收效率。

综上，饲喂低DCAD饲粮能提高血钙水平的恢复速率，上调钙调控因子水平，加强胃肠道吸收钙入血过程的化学反应。

3.4 低DCAD饲粮对山羊瘤胃发酵的影响

反刍动物的瘤胃pH、NH3-N 和VFA 是评价瘤胃发酵状态和正常功能的首要指标，反映出瘤胃微生物对饲料养分的消化吸收情况。瘤胃pH 的大小表明瘤胃是否处于健康状态，与瘤胃微生物对纤维素的消化程度直接相关。莘海亮等通过对山羊饲喂不同DCAD 水平饲粮，发现低DCAD 饲粮组的瘤胃pH与高DCAD 饲粮组相比差异不显著。这与本试验结果类似，也得到其他报道的支持。以上研究充分说明了，饲喂含阴离子盐饲粮并不会引起瘤胃酸碱度的明显改变，不会对瘤胃pH 产生明显影响。瘤胃内含氮物的代谢主要是能利用饲料的蛋白质和非蛋白氮，同时合成微生物蛋白供机体所用，常用瘤胃NH3-N 来衡量氮的代谢利用情况。Wang 等报道，DCAD 变化不会影响瘤胃pH、NH3-N 和TVFA 的摩尔百分比。本试验结果也表明，处理组瘤胃NH3-N 水平与对照组相比也未产生显著差异。TVFA 主要包括乙酸、丙酸、丁酸等，是饲料碳水化合物（carbohy⁃drate, CHO）被瘤胃微生物降解的产物，在瘤胃壁吸收后氧化供能，主要受饲粮碳水化合物含量的影响。Nguyen 等最新研究表明，DCAD 水平变化不会影响奶山羊瘤胃TVFA、丙酸和乙酸/丙酸水平。本试验结果显示，处理组乙酸、丁酸、乙酸/丙酸、TVFA与对照组差异不显著，但丙酸含量显著高于对照组，其原因有待于进一步研究。

4 结论

山羊饲粮添加EDTA可降低血钙水平，在此条件下饲喂低DCAD饲粮有利于血钙水平的恢复，且并不会影响瘤胃发酵。但有关EDTA 降低血钙的分子机制、低DCAD饲粮对胃肠道组织钙调因子表达水平及信号通路的影响尚待进一步深入研究。