骨髓间充质干细胞分离与培养技术

段长伟，柴彦杰，赵疆东，薛 桐，孙 权，胡泽兵

1970年，Friedenstein首次从骨髓中分离出一种多能基质细胞，呈梭形，可以进行体外克隆和多向分化，被称为CFU-Fs(colony-forming unit fibroblasts)，随后发现这种骨髓来源的基质细胞是间叶组织细胞谱系的共同前体细胞，因其具有干细胞的部分特性，而被命名为骨髓间充质干细胞(BMSCs)。BMSCs是一种能够进行体外贴壁增殖、具有成纤维细胞样形态和多向分化潜能的异质性细胞群，其在特定诱导条件下可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等细胞谱系。由于BMSCs易于分离和保存，具有“归巢”特性、免疫原性低、肿瘤风险低、伦理争议小等优势，其在细胞治疗和再生医学领域表现出广阔的应用价值。但因缺乏统一标准，BMSCs在体外扩增时的纯度、活性、表型和分化潜能差异很大，这成为导致基础研究结论各异和临床试验效果不一的重要原因[1]。因此，深入认识BMSCs不同分离方法和培养条件的优缺点，并根据实验目的做出相应选择，是进行BMSCs实验研究的关键环节。本文主要就BMSCs在分离培养中的实验要点和研究进展进行综述。

1 骨髓间充质干细胞的分离

BMSCs的种属来源丰富、分离培养简单，目前研究中主要使用的BMSCs来自于人、大鼠、小鼠、犬等，采用的方法主要有差速贴壁法、密度梯度离心法、免疫磁珠分选法、流式细胞分选法等。但是不同的种属来源和分离方法对BMSCs的细胞表型和增殖分化能力具有较大影响，应根据具体试验目的选取合适的技术才能最大程度地减少BMSCs研究的差异性。

1.1 差速贴壁法:差速贴壁法是传统的BMSCs分离方法，它利用了BMSCs与骨髓中其他细胞的贴壁性能差异及酶消化敏感性差异而逐步达到纯化扩增目的。骨髓中细胞谱系复杂，贴壁生长能力差异较大，其中以巨噬细胞和内皮细胞最容易贴壁，其次是成纤维细胞和成纤维样细胞，最差是脂肪细胞和造血干细胞，同时BMSCs的酶消化敏感性较高，因此可以通过差速贴壁和胰酶消化的方式逐渐分离出富含BMSCs的细胞群。传统操作方法是用培养基将骨髓冲制成细胞悬液，接种在培养皿中后每3 d换液以去除未贴壁细胞，经过3～4次消化传代后逐渐纯化BMSCs[2]。由于换液和酶消化是贴壁法的关键步骤，也有研究从细化换液和消化时间、调整首次酶消化顺序等方面做了调整[3]，而huang等人则尝试先用骨髓团块法贴壁，以保留BMSCs原始环境而促进其快速增殖[4]。差速贴壁法是一种快速、简单、经济的BMSCs分选方法，但是获得的细胞纯度相对不高。和消化时间、调整首次酶消化顺序等方面做了调整[3]，而huang等人则尝试先用骨髓团块法贴壁，以保留BMSCs原始环境而促进其快速增殖[4]。差速贴壁法是一种快速、简单、经济的BMSCs分选方法，但是获得的细胞纯度相对不高。

1.2 密度梯度离心法:密度梯度离心法是针对骨髓中不同细胞的大小和密度差异进行分选。骨髓细胞悬液加入到密度梯度离心液上面，通过离心使得不同类型细胞沉降至其等密度点，然后吸取特定位置富集的细胞。在离心分层时，红细胞及多核细胞因比重(1.080 g/mL)较大而沉降于底部，其次是单个核细胞(包括BMSCs、造血干细胞、单核细胞等)，悬浮密度位于(1.053～1.075)g/mL，血浆及其溶解物悬浮密度位于1.050 g/mL，而脂肪细胞将漂浮于上层。常见的梯度离心液有Ficoll、Ficoll-Paque、percoll、Lymphopre等，其具有低粘性和低渗透性，使用密度约为1.077 g/mL，经过800 g转速离心20 min后，可见离心管内液体明显分层，位于分离液之上的灰白色云雾状层即为单个核细胞层，在获取该层细胞后再通过差速贴壁法去除未贴壁细胞[5-6]。密度梯度离心是一种非常经济的BMSCs分选技术，但其分选的细胞特异性有限。此外，即使它是常见的实验室技术，密度梯度离心也是一个难以掌握的、缓慢的操作过程。

1.3 细胞表面标志物分选法:基于细胞表面标志物的分选方式主要通过特异性识别BMSCs上的表面抗原而针对性筛选出目的细胞。BMSCs的特异性分选和鉴定是分不开的，用来鉴定的表面抗原也常被当做识别靶标，但是由于BMSCs缺乏单一有效的特异性表面抗原，所以对于哪些标志物适宜作为靶标尚未有定论。目前已报道的有STRO-1、CD146、CD105、SUSD2、Sca-1/CD90/PDGFRa、leptin受体等[7-10]。在选定识别靶标后又可以采用荧光和磁珠等方式对其相应抗体进行标记或结合，即目前已经成熟应用于BMSCs富集的方式主要有流式细胞荧光分选法(FACS)和免疫磁珠分选法(MACS),二者分别以电场和磁场形式施加作用力而分离目的细胞。在实际应用中，MACS操作简单而快速，细胞通量高，成本相对低，对细胞活性影响低，但是无法同时标记两个或多个生物标志物；而FACS法操作较复杂，对实验要求高，价格昂贵，细胞通量低而分选时间长，对细胞活性影响相对较大，但是分选所获细胞的纯度更高，也可以同时对多个表面标志物乃至细胞内标准物进行识别[11]。

上述四种分选方法中，由于FACS和MACS分选法的细胞通量较低，难以满足临床BMSCs应用研究中细胞用量较大的需要，同时经过了磁场或电场的作用难以评估对细胞功能的影响程度。所以，目前在临床试验中应用的BMSCs分离技术还是以差速贴壁法和梯度离心法为主[12]。

2 骨髓间充质干细胞的鉴定

BMSCs细胞形态呈梭形，可聚集成均匀集落，在光学纤维镜下有类似成纤维细胞的特征。但是，体外培养的BMSCs缺乏特异性和唯一性的标记物，现在普遍采用的鉴定方法是ISCT于2006年提出的关于人源MSCs的最低鉴定标准[13]，包括:①在体外标准培养条件下，细胞必须是呈梭形形态的黏附细胞；②通过流式细胞术检测，细胞表面抗原表达CD105，CD73和CD90必须≥95%，同时表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α，或CD19 和HLA-DR必须≤2%；③细胞在标准体外分化条件下能够分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。在其他物种来源的BMSCs鉴定中，大部分研究也借鉴了这些标准，但是需要注意的是，不同物种来源的BMSCs某些表面抗原表达存在较大差异性。这些最低标准的设定是在造血干细胞和骨髓基质细胞之间划定了界限，旨在缩小因不同分离和培养条件而导致的研究差异性。但是，随着MSCs临床应用研究的不断增长，迫切需要开发能够更好地表征分离所得BMSCs增殖分化潜能甚至是预判临床治疗效用的标志物。BMSCs鉴定新标准的方向主要在于对表面抗原的细化分层分级，以及融入其他功能性判定指标，比如旁分泌能力、低免疫原性、“干性”相关基因表达等[14- 15]，而这一过程面临的主要挑战仍然是BMSCs的细胞异质性问题。

当前，已有不少文献对BMSCs主要表面抗原或者功能相关分子的表达进行了更为细致的报道，有研究小组对不同捐献者骨髓分离出的BMSCs进行了对比研究，按照体外扩增速率将BMSCs分为高增殖组和低增殖组，2组患者都符合ISCT标准，但是高增殖组BMSCs具有集落形成率高、体内异位成骨能力强等特点，存在细胞表面标志物STRO-1、PDGFR‐α(CD140a)高表达和细胞内基因TWIST-1、DERMO-1高表达[16]。Jin等模拟天然骨细胞外基质构建了纤维内矿化胶原蛋白支架并将其植入大鼠下颌骨缺损处，募集到更多的表达CD146+STRO-1+的BMSCs，骨再生能力得到显著增强[17]。这些研究为更好地开展BMSCs实验和建立功能性鉴定标准提供了参考。

3 骨髓间充质干细胞的培养

BMSCs在生物体骨髓中的含量非常少，直接分离所得的初代细胞数量远远无法满足科学研究以及临床试验需求，必须经过体外扩增以获取更多的高纯度、强活性克隆集落。BMSCs分离的难点在于保证细胞纯度，而培养的难点却在于保持细胞活性，不同种属来源的BMSCs在体外培养扩增方法基本相似，但是细微的营养条件、培养环境等差异都将会对细胞性能产生影响，因此在研究中必须综合考量并合理优化。

3.1 培养条件:目前使用的基础培养基多是αMEM或者DMEM培养基，二者在基本成分方面对BMSCs细胞特性影响不大，主要影响因素在于血清、葡萄糖、生长因子、氧气等。①血清。胎牛血清(FBS)已被证实可以用来为BMSCs体外生长提供营养，使用浓度在为5%～20%，以10%为居多；但是，有研究者认为FBS会给BMSCs培养带来异种蛋白或微生物的输入风险，建议使用同源性血清提取物作为营养来源，也有商用无血清培养基在人源BMSCs体外培养中显示出良好性能[18]。②生长因子。尽管FBS已被接受用于临床试验级别的人源BMSCs体外培养，但是很多研究者将目光转向生长因子添加物，以替代FBS进行培养条件优化，包括人血清、血浆、血小板衍生生长因子、TGF-β1、IGF等[19-21]，其在保持人源BMSCs细胞特异性方面显示出较好效果。③葡萄糖。葡萄糖是培养基中最常见的添加剂，由于健康生物体血清内的葡萄糖生理水平维持在1 mg/mL，所以也建议BMSCs培养时使用低糖培养基(1 mg/mL)[22]；葡萄糖浓度变化会影响BMSCs的细胞性能，高糖培养基(4.5 mg/mL)会减弱BMSCs的增殖能力并诱发过早衰老。④谷氨酰胺。谷氨酰胺是一种蛋白和氨基糖合成所必需的氨基酸，其与葡萄糖一样在BMSCs培养中必不可少，尤其是在低糖低氧培养而又所需能量比较高时，可以作为BMSCs生长的补充能量来源[23]。⑤氧气浓度。BMSCs所处的骨髓内微环境属于低氧环境，根据离血管网的距离而在1%～8%之间变化[24]，因此体外培养的给氧浓度也应以低氧为宜，一般多选择2%～5%[9,25]，低氧环境会降低BMSCs体外生长时细胞内氧化应激物浓度、减少DNA损伤、延缓细胞衰老并维持细胞分化能力[26]。

3.2 接种、传代及冻存:细胞接种密度是BMSCs体外扩增时的重要问题。在骨髓细胞悬液的初代培养中，差速贴壁法分离时一般多以1×106～2×106个/cm2进行接种[2- 3]，密度梯度离心法分离时以约1×104个/cm2密度接种为宜[27]。而在传代过程中，BMSCs接种密度多在2 000～5 000个/cm2。有研究显示，低密度接种可能会因减少接触抑制而有利于细胞的增殖，而且低密度接种不易影响细胞表面抗原表型和细胞分化能力[28-30]。与接种密度同样重要的还有传代次数，随着体外扩增的进行，BMSCs会出现复制性衰老，表现为染色体端粒逐渐缩短、 “干性”减弱、突变风险增加[31- 32]。由于培养体系和判断标准的不同，BMSCs体外培养的代数尚未有定论，一般认为1 520代已经属于近衰老状态[1,33]。冻存是细胞储存的重要手段，其在BMSCs体外保存和运输中同样适用，但是对于冻存是否影响细胞的活性尚有争议。SOUKAINA等比较了不同冻存条件(冻存程序、时间、次数，冻存液成分、冻存细胞浓度等)对BMSCs性能(标志物表达、分化潜能、生长能力、迁移特性、基因表达等)的影响，对于BMSCs保存与运输以及相应标准的制定具有一定参考价值[34]。

BMSCs研究一直是细胞治疗和再生医学领域的热点之一，但是随着研究的深入，在细胞的分离、鉴定、培养以及储存等方面遇到很多问题，这些问题的核心在于尚未建立统一的研究标准，这也是导致BMSCs研究结果复杂各异的重要原因之一，也是BMSCs应用于再生医学领域的重要障碍。本文总结了BMSCs实验研究中的一些基础问题，旨在为该领域研究者提供宏观上的认识和具体操作细节上的参考。尽管关于BMSCs实验技术方法的研究还不够彻底，但是研究者正在不断努力改进相关方法技术，可以预见会有更好的方法获得均一、高活性的BMSCs，其所具有的自我复制、多向分化、免疫抵抗、分泌效应等生物学特性会在临床疾病的治疗发挥更大作用。