microRNA在自身免疫性肝病中的作用

蔡萌强，刘素彤，刘君颖，张丽慧，赵文霞

1 河南中医药大学 第一临床医学院，郑州 450000； 2 河南中医药大学第一附属医院 脾胃肝胆科，郑州 450000

自身免疫性肝病(autoimmune liver disease，AILD)是一类由异常自身免疫反应介导的肝组织炎症反应，导致肝细胞和/或胆管上皮细胞损伤的慢性肝胆系统炎性疾病。根据生化学、组织病理学及免疫学特征，可分成以肝细胞损伤为主的自身免疫性肝炎(AIH)和以胆管上皮细胞损伤为主的原发性胆汁性胆管炎(PBC)及原发性硬化性胆管炎(PSC)；同时具备上述两种组织学特征的则称为重叠综合征[1]。尽管目前对环境因素和遗传易感性在触发免疫性肝损伤中的认识逐年增加，但AILD的确切发病机制仍未阐明[2]。AILD常伴有肝细胞和/或胆管上皮细胞的免疫炎症损伤和慢性损伤修复反应，易进展为肝硬化，肝衰竭，甚至肝细胞癌，因此早期诊断、及时干预是改善AILD预后的关键。

microRNA (miRNA)是一种内源性、短链非编码RNA分子，通过与转录后mRNA互补区域结合，诱导mRNA降解或抑制基因转化后翻译，调控靶基因表达。单一miRNA可调节数百个蛋白质编码基因，对细胞生物学过程(包括代谢、免疫、增殖和凋亡、发育和分化)起重要的调控作用[3]。miRNA作为生物标志物、潜在治疗工具或靶点，在肝脏疾病中已进行了广泛的研究[4]。近年来，越来越多研究发现miRNA异常与AILD发病过程中的免疫炎症反应、肝纤维化密切相关，miRNA可通过影响肝脏免疫细胞分化、胆管上皮细胞分泌及肝星状细胞激活等，参与ALID发生发展过程。

1 miRNA与AIH

AIH是由于自身免疫异常攻击肝细胞，导致肝细胞炎症损伤、肝纤维化，甚至肝衰竭。以血清转氨酶和IgG增高、自身抗体阳性为血清学特征，以肝组织出现中重度界面性肝炎为组织学特征[5]。然而目前AIH发病机制尚不清楚，发病机制可能与遗传易感性、细胞分子机制及免疫调节功能缺失相关[6]。研究发现，与健康对照相比，AIH患者的miRNA谱发生明显改变，提示miRNA可能参与AIH的发生发展过程。

1.1 miRNA参与肝脏免疫炎症反应 CD4+T淋巴细胞是一种重要的免疫细胞，在AIH中，免疫介导的肝损伤是由自身反应性CD4+T淋巴细胞引起的[7]。有学者[8]认为，调节性T淋巴细胞 (Treg) /辅助性T淋巴细胞 (Th) 17及其相关细胞因子分泌失衡可能是AIH的一个重要发病机制。miR-155是一种在淋巴细胞内高表达的miRNA，可通过调控Treg和Th17分化，参与多种自身免疫性疾病的发生发展过程[9-10]。Xia等[11]发现在刀豆蛋白A (ConA)诱导的AIH小鼠模型中，肝组织miR-155明显升高，并在48 h时达正常对照组的9.2倍。研究发现，抑制miR-155表达，可显著阻止AIH小鼠肝脏Th17和Treg分化，而且由Th17分泌的促炎因子(IL-17A、IL-23)也明显降低，但由Treg分泌的抗炎因子(IL-10)未受到影响。不仅如此，抑制miR-155表达后，由ConA诱导的血清ALT、AST、ALP升高亦被显著抑制。Blaya等[12]发现，与健康对照相比，AIH患者肝组织miR-155表达显著增高(较正常对照增加7.6±5.6倍)；而外周血单核细胞miR-155表达却降低，且经过免疫抑制治疗后，外周血单核细胞中的miR-155水平仍无显著改变；进一步将敲除miR-155基因小鼠和野生型小鼠同时注射ConA后，与野生型小鼠相比，miR-155缺陷小鼠肝组织炎症坏死更显著，血清ALT、AST以及受体相互作用蛋白激酶(RIPK1、RIPK3)等凋亡相关因子水平显著增高。因此，miR-155在免疫介导的肝损伤中可能具有多效性作用，在肝组织和炎症细胞中的正确表达可能均重要。

外泌体是一种脂质双层膜小泡，可由多种细胞分泌，直接将供体细胞中的mRNA、miRNA及蛋白质等生物活性分子转移至受体细胞，以调控受体细胞反应[12]。Chen等[13]发现小鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSC)的外泌体可减轻由肝脏特异性抗原S100、内毒素(LPS)诱导的AIH模型小鼠的肝损伤，其机制与抑制淋巴细胞浸润及血清TNFα、IL-17A和IL-1β水平相关；当应用转染miR-223前体的BMSC外泌体时，其对AIH小鼠肝损伤的保护作用更显著；而转染miR-223抑制剂时，外泌体的保护效果完全消失。研究结果表明miR-223对S100和LPS诱导AIH模型小鼠肝损伤具有显著保护作用。新近研究[14]发现，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)异常活化参与了许多自身免疫性疾病的进展。的确，NLRP3信号通路在AIH小鼠中被显著激活，研究发现含miR-223的BMSC外泌体可下调NLRP3，提示miR-223可能通过调控NLRP3信号通路防治AIH疾病进展。

1.2 miRNA参与AIH肝纤维化 目前以糖皮质激素联合硫唑嘌呤为主的治疗方案可使38%～93%的AIH患者得到缓解，但仍有30%～50%的患者治疗无效从而进展为肝硬化[15]。Tu等[16]研究发现AIH相关肝纤维化小鼠肝组织内miR-143水平明显低于正常对照，作者通过转染miR-143使AIH小鼠体内miR-143过表达，发现转染miR-143组小鼠血清和肝组织内TNFα、核因子-κB(NF-κB)及Ⅳ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TGFβ等促肝纤维化基因表达水平显著低于无转染AIH对照小鼠[17]，且肝脏形态及大小基本恢复正常；进一步发现，转化生长因子活化激酶1(transforming growth factor-β3activated kinase 1,TAK1)磷酸化水平随肝损伤程度增加而上调，经miR-143干预的AIH小鼠肝组织TAK1磷酸化水平明显降低，提示TAK1可能是miR-143的下游靶点。研究结果表明，miR-143可通过调节TAK1磷酸化改善由S100和LPS诱导的AIH小鼠肝组织炎症损伤和纤维化。

1.3 miRNA作为AIH的生物标志物 miR-122是肝细胞内表达量最高的一种miRNA，占肝脏miRNA总量的70%以上，具有高度的肝脏特异性。病理状态下，miR-122可参与多种肝脏疾病(如乙型肝炎、丙型肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、药物性肝炎、肝癌等)的发生发展过程[18-20]。Migita等[21]发现AIH患者与健康受试者相比，体内miR-122明显升高(可达7.34倍)，并与患者血清ALT、AST水平呈正相关，且经糖皮质激素治疗好转后其水平明显下调。众所周知，miR-21可通过维持T淋巴细胞增殖与抑制其凋亡，调节细胞免疫参与多种自身免疫疾病[22]。与miR-122类似，miR-21在AIH患者血清中明显增高，且与AIH患者血清ALT、AST相关性更显著[21]。然而，AIH肝硬化晚期患者血清miR-122和miR-21却明显降低，且与肝纤维化评分呈负相关。但在组织学方面，仅miR-21表达水平与AIH炎症的组织学分级呈正相关。因此，miR-122和miR-21有潜力成为评估AIH患者肝损伤程度和疾病状态的生物学标志物。由于miR-122在多种肝损伤模型中均表达增高，作为诊断标志物，敏感性较高，特异性较低；而miR-21仅在AIH炎症损伤时增高，对评估AIH炎症损伤具有更好的特异性。

2 miRNA与PBC

PBC是一种以肝内胆管破坏为特征的自身免疫性慢性胆汁淤积性肝病[23]，疾病主要发生于40岁以上的女性(男∶女为1∶9～10)[24]。PBC血清学特征为持续高滴度抗线粒体抗体阳性，病理生理与机体对丙酮酸脱氢酶复合物E2亚基(PDC-E2)免疫耐受性丧失有关，导致靶向损伤胆道上皮细胞[25-26]；组织学特征包括门静脉淋巴细胞浸润、选择性破坏肝内胆管、胆管纤维化。熊去氧胆酸(UDCA)可提高PBC患者无肝移植生存率，但仍有约40%PBC患者对熊去氧胆酸治疗无应答[23]，最终发生肝纤维化甚至肝衰竭。目前已经发现多个miRNA在PBC患者中呈差异性表达，呈现出不同的miRNA表达谱，miRNA可通过影响PBC患者胆管细胞分泌、免疫细胞凋亡、分化及炎症损伤等方面参与PBC的病理进展过程。

2.1 miRNA调控胆汁分泌 阴离子转换蛋白2(anion exchanger 2，AE2)是胆道上皮细胞内Cl-/HCO3-的交换器，可调节细胞内pH和胆管碳酸氢盐分泌，在胆管细胞顶端表面形成富含碳酸氢盐的“保护伞”，使胆管上皮细胞免受疏水胆汁酸的影响，下调AE2表达可能引起胆汁淤积和胆管细胞损伤，导致对易感者胆管细胞免疫耐受破坏并继发自身免疫反应[25,27]。与正常肝组织相比，PBC患者肝组织内miRNA-506上调3.4倍，原位杂交显示miRNA-506主要位于肝内胆管上皮细胞中[28]。胆管细胞内miRNA-506通过与AE2 mRNA 3′未翻译区(3′UTR)结合，抑制蛋白翻译，下调AE2表达及活性，降低Cl-/HCO3-交换，导致胆道上皮细胞线粒体功能障碍、胞内PDC-E2过表达以及对胆盐敏感性增加，从而诱导胆管细胞凋亡、增殖。因此，抑制胆管细胞内miRNA-506表达可使AE2活性增加，从而发挥治疗作用。此外，胆管细胞中，Ⅲ型肌醇1,4,5-三磷酸受体(the type Ⅲ inositol 1,4,5- trisphosphate receptor，InsP3R3)是细胞内Ca2+信号的主要信使分子，负责触发基底外侧Ca2+流向，InsP3R3在PBC患者胆管细胞表达下调，引发细胞内Ca2+信号和胆汁碳酸氢盐分泌受损，可导致胆汁淤积[29]。miR-506是表观调控胆管细胞InsP3R3表达的主要因子，miR-506上调可直接抑制InsP3R3表达，进而抑制PBC患者胆管细胞分泌。因此，miR-506对InsP3R3表达的影响，与PBC患者的AE2下调具有协同作用，进一步降低胆管细胞的胆汁分泌，可能是miR-506调控PBC疾病进展的主要机制。也已证实，miRNA-506定位于Xq27.3，是一条X连锁miRNA[30]，因此，从表观遗传学角度分析，表观遗传X失活和由此产生的miR-506上调, 可能与PBC发病主要为女性密切相关。

2.2 miRNA调控胆管的免疫炎症反应 研究[31]发现，在PBC患者外周血、肝脏及淋巴结内与PDC-E2发生反应的CD4+T淋巴细胞数量明显增加，提示CD4+T淋巴细胞在PBC发病机制中可能起重要作用。Nakagawa等[32]通过微阵列和qRT-PCR在研究PBC患者CD4+T淋巴细胞内的miRNA时，发现有miR-181a、miR-181b、miR-374b、miR-425 4种miRNAs表达下调。N-Ras作为T淋巴细胞受体信号通路上游靶点，是PBC胆管细胞衰老相关因子，可活化T淋巴细胞参与PBC发展过程[33]，微阵列研究和靶点预测提示：miR-181a、miR-181b、miR-374b、miR-425可能参与协同调节N-Ras靶点，继而通过T淋巴细胞受体信号通路引发肝内炎症因子表达增加。同时体外试验发现，当miR-425过表达时，可抑制N-Ras靶点及相应炎症因子(IL-2、INFγ)表达。

Th17可在自身免疫和病原入侵的背景下，分泌IL-6、IL-17、IL-22、TNFα等多种细胞因子发挥免疫调节和促炎作用[34]。Song等[35]发现与正常人和乙型肝炎患者相比，PBC患者外周血Th17占比显著升高，且T淋巴细胞内miR-181a表达下调。进一步研究发现，PBC患者体内抗细胞凋亡蛋白(Bcl-2)表达水平显著增高；Bcl-2蛋白表达不仅与miR-181a水平呈负相关，且与Th17占比呈正相关。研究结果表明，miR-181a的下调可通过增加Bcl-2表达，以抑制Th17凋亡，进而促进PBC疾病进程中的T淋巴细胞活化。Liang等[36]分析PBC患者血浆和外周单核细胞内miRNA后，发现无论血清还是单核细胞，miR-92a表达均下调，且与PBC患者外周血Th17占比呈负相关；进一步研究发现外周单核细胞内miR-92a和IL-17A可以共表达，表明miR-92a可能引发T淋巴细胞亚群失衡，特别是调节Th17增加，最终在PBC疾病进展中扮演重要角色。

3 miRNA与PSC

PSC是一种罕见的慢性进展性胆道疾病，其特征是自身免疫反应诱导的胆管损伤、多发性胆管狭窄、胆汁淤积，继而发生肝组织炎症、纤维化甚至胆管恶性肿瘤。PSC病因和发病机制极其复杂，具体病理生理机制尚不清楚。与其他自身免疫性肝病不同，PSC发病人群主要为青年男性。此外，PSC与炎症性肠病密切相关，70%的PSC患者伴发炎症性肠病，5%～10%的炎症性肠病患者合并PSC[37]。并且迄今为止，尚无药物治疗对临床结局有显著影响，肝移植仍是大多数患者的最终需要[38]。目前miRNA与PSC的研究主要集中于参与并调控PSC肝纤维化进展的研究方向。

多药耐药基因-2敲除小鼠(Mdr2-/-)与人类PSC临床过程相似，因此常被用作为研究PSC的模型[39]。胆道损伤和增生性肝纤维化是PSC和Mdr2-/-模型的典型病理特征。miR-200b的表达在晚期PSC患者和Mdr2-/-的胆管细胞中均增加，体外应用miR-200b抑制剂处理人肝星状细胞可降低肝星状细胞中促纤维化基因和血管生成基因(VEGF-A/C, VEGFR-2/3等)表达，减轻肝纤维化[40]。研究发现，以褪黑素预处理或长期暴露于黑暗环境中的Mdr2-/-胆管细胞miR-200b显著降低，提示褪黑激素/miR-200b轴可能是包括PSC在内的胆管损伤和纤维化的治疗靶点。Hall等[41]研究发现miR-24/menin调节轴可能在PSC发展至肝纤维化过程中发挥作用。Menin蛋白可通过调节TGFβ1通路参与肝纤维化过程[42]，与野生对照小鼠相比，Mdr2-/-PSC模型小鼠饲养至12周时，肝组织menin水平降低，但在66周时明显增加，而肝组织miR-24表达却与menin变化完全相反。进一步研究发现，抑制miR-24表达后，肝组织menin及促纤维化因子(TGFβ1、α-SMA等)表达均明显增加，表明miR-24可负调控menin参与胆汁淤积性肝病的纤维化过程。miR-24/menin调节轴在PSC患者疾病进展中的作用仍有待进一步研究。

4 展望

AILD的病因、发病机制仍未完全阐明，既是基础研究的热点，也是临床诊疗的难点。随着miRNA调控免疫、胆汁代谢、肝组织炎症损伤及纤维化修复证据的增加，必将加深人们对miRNA在AILD中作用的理解，为AILD诊断、防治及预后评估提供新的标志物及潜在治疗靶点。日益增加的证据显示miRNA可能参与了AILD发生发展过程的调控，但miRNA在AILD临床诊疗中的价值仍有待临床数据的积累及论证，这可能是AILD未来研究的一个方向。

作者贡献声明：蔡萌强负责资料收集、撰写论文；刘素彤、刘君颖、张丽慧负责修改论文；赵文霞负责拟定研究方向、写作思路，指导撰写文章并最后定稿。