茵陈蒿汤物质基准特征图谱的建立

杜微波，张志强，万莹莹，陈敬然，沈建梅

(北京康仁堂药业有限公司，中药配方颗粒关键技术国家地方联合工程研究中心，北京市中药配方颗粒工程技术研究中心，北京101301)

茵陈蒿汤出自张仲景所著《伤寒论》[1]，主要由茵陈、大黄和栀子三种成分组成，功效为清热祛湿、利胆退黄，用于治疗湿热黄疸。现代研究发现，茵陈蒿汤有利湿退黄、促进胆红素代谢、修复肝损伤等功效。

国家食品药品监督管理总局在《中药经典名方复方制剂简化注册审批管理规定(征求意见稿)》[2]中明确指出，将经典名方物质基准作为中药药用物质标准，依据古代典籍中记载的制备方法制备，经方物质基准应以主要药效物质为研究基础，以确保经方制剂与传统中医临床所使用的质量疗效一致。因此如何建立经方物质基准药效的质量评价方法是中医药现代化研究的重点，也是开发经方制剂的关键通路。

特征图谱是通过反映中药化学成分中某些重要的特征信息，进而控制中药质量的研究方法，能够确保其内在质量的均一、稳定[3]。因此本研究根据各药味在处方中的作用，针对各药味关联的药效成分进行目标成分的选取，以期建立能够真实、全面反映茵陈蒿汤药效的特征图谱，以评价经典名方物质基准的质量，为后续的药物开发及质量控制提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

岛津LC-20A型液相色谱仪，安捷伦1260II型液相色谱仪，十万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司BT25S)，万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司MS204TS/02)，千分之一电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司SQP)，超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司 KQ-300DB)。

1.2 材料

没食子酸(批号：110831-201605，中国食品药品检定研究院，纯度90.81%)，绿原酸(批号：110753-201617，中国食品药品检定研究院，纯度91.8%)，秦皮乙素(批号：110741-201708，中国食品药品检定研究院，纯度99.9%)，栀子苷(批号：110749-201718，中国食品药品检定研究院，纯度97.6%)，金丝桃苷(批号：111521-201708，中国食品药品检定研究院，纯度95.7%)，槲皮素(批号：100081-201610，中国食品药品检定研究院，纯度99.1%)，大黄素(批号：110756-201512，中国食品药品检定研究院，纯度98.7%)，芦荟大黄素(批号：110795-201710，中国食品药品检定研究院，纯度98.3%)，大黄酸(批号：110757-201607，中国食品药品检定研究院，纯度99.3%)；乙腈(色谱纯HPLC)，无水乙醇(分析纯AR)，甲醇(分析纯AR)，磷酸(色谱纯HPLC)，蒸馏水；实验用饮片均在北京康仁堂药业有限公司购买，并经过检测符合药典标准。

2 方法与结果

2.1 目标物质的选择

茵陈蒿汤用于治疗肝病的一个经典名方，功效为清热、利湿、退黄。其中君药为茵陈，有清热利湿、利胆退黄之功；臣药为栀子，可泄热退黄，清解三焦之热；佐药大黄，清利湿热，泄热通便，化瘀破结。现代药理研究发现，茵陈蒿汤治疗肝病的作用机制主要为修复肝损伤、抗肝纤维化、改善肝脂肪代谢、利胆等[4]。

君药茵陈主要的化学成分有香豆素、黄酮、有机酸类等。其中有研究表明香豆素类与茵陈保肝作用相关，可以抑制因四氯化碳引起的肝体比的上升，以及阻止血中丙二醛形成及丙氨酸氨基转移平的升高，具有抗脂质过氧化的作用[5]；有机酸与茵陈清热利湿、利胆作用相关，有明显的抗病毒、保肝利胆等作用[6-7]。

臣药栀子主要成分为环烯醚萜苷类[8]，其中栀子苷存在较强的药理活性。孙旭群等[9]研究表明：栀子苷与栀子的利胆退黄作用相关，能显著增加6 h内正常大鼠和肝损伤大鼠的胆汁排泌量，在0.2～1.6 g范围内其利胆作用的差异显著，尤其在是给药2 h和肝损伤模型中表现更为明显。

佐药大黄含有蒽衍生物类、有机酸类、黄酮类及其苷类化合物和鞣质类等多种有效成分。研究表明蒽醌类具有保肝降酶作用，通过抑制四氯化碳所致的总蛋白、白蛋白的下降及急性肝损伤小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶的升高[10]，与大黄保肝作用相关；鞣质则具有较好的自由基活性氧的功能，与大黄泻热通便作用相关[11]；黄酮类成分与大黄利湿、保肝作用相关，可降低尿中白蛋白量，对肾病理组织学病变亦有明显改善作用，降低模型大鼠血清中葡萄糖、尿素氮、肌酸酐、三酰甘油和总胆固醇含量[12]，并对四氯化碳肝损伤的小鼠具有良好的保肝降酶作用。

根据对各药味的药理学作用结合茵陈蒿汤中药味功效及作用机制，确定对茵陈中香豆素类及有机酸、栀子中环烯醚萜苷类、大黄中蒽醌类、黄酮类及鞣质成分进行特征图谱研究，根据特征图谱技术要求，采用HPLC法建立茵陈蒿汤基准物质的特征图谱，以保证能够全面反映茵陈蒿汤的功效特点。

2.2 色谱条件的选择

茵陈蒿汤成分中蒽醌类多为小极性成分，环烯醚萜、黄酮、香豆素类多为中极性成分，鞣质、有机酸类多为大极性成分。因此针对特征图谱目标物质进行文献检索，结合统计结果，确定流动相及基本的梯度，进行方法优化，得到茵陈蒿汤物质基准的特征图谱色谱条件：Agilent-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)色谱柱；检测波：254 nm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；流动相：乙腈(A)-0.05%(B)磷酸溶液。按表1进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 供试品溶液的制备 对茵陈蒿汤物质基准目标物质的极性情况分析可知，其中茵陈、栀子水溶性成分较多，大黄脂溶性成分稍多。分别以水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇作为提取溶媒进行比较，发现30%乙醇特征图谱的色谱峰信息较丰富，并能够兼顾物质基准的各类目标物质，因此确定以30%乙醇作为提取溶媒。

采用30%乙醇作为提取溶媒，分别考察不同提取方式(热回流提取、振摇提取、超声提取)，在确定提取方式的基础上对提取时间(15 min、30 min、45 min)进行考察。由比较结果可知，三种不同方式以及提取时间获得的特征图谱信息差异不大，考虑到操作便利性以及为保证各类化学成分的提取充分，确定提取方式采用超声，提取时间为30 min。

综上，确定供试品溶液的制备方法为：取本品约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30%乙醇溶液25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)30 min，取出，放冷，称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 阴性溶液的制备 根据处方，分别制备缺少茵陈、栀子、大黄的样品，按照茵陈蒿汤基准物质制备过程制备相应的阴性样品。取阴性样品0.5 g，按“2.3.1”项下“供试品溶液制备方法”制备阴性溶液，即得。

2.3.3 对照品溶液的制备 取没食子酸、绿原酸、秦皮乙素、栀子苷、金丝桃苷、槲皮苷、大黄酸、大黄素对照品适量，精密称定，置量瓶中，加甲醇制成每1 mL含60μg、40μg、50μg、80μg、100μg、50μg、70μg、70μg的溶液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取茵陈蒿汤物质基准粉末0.5 g，精密称定，按“2.3”确定的供试品溶液制备方法和“2.2”确定的色谱条件进行操作，连续进样6次，以绿原酸峰为S峰，计算相对保留时间，各特征峰的相对保留时间RSD小于2%，表明仪器精密度良好。见表2。

表2 精密度试验结果

2.4.2 重复性试验 取茵陈蒿汤物质基准粉末0.5 g(共6份)，精密称定，按“2.3”确定的供试品溶液的制备方法和“2.2”确定的色谱条件进行操作，以绿原酸峰为S峰，计算相对保留时间，各特征峰的相对保留时间RSD小于2%，说明本方法的重复性良好。见表3。

表3 重复性试验结果

2.4.3 稳定性试验 取茵陈蒿汤物质基准粉末0.5 g，精密称定，按“2.3”确定的供试品溶液的制备方法和“2.2”确定的色谱条件进行操作，分别在制备后放置0、2、4、6、8、10、12、24 h进样测定，以绿原酸峰为S峰，计算相对保留时间。在24 h内各特征峰的相对保留时间RSD小于2%，供试品溶液中化学成分在24 h内稳定性良好。见表4。

表4 稳定性试验结果

2.5 共有峰的确定及归属

2.5.1 共有峰的确定 测定15批茵陈蒿汤物质基准，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.1版本)，以1号为参照图谱，按中位数计算，进行共有峰标识，共获得23个峰，见图1。

图1 共有峰标识

2.5.2 共有峰归属 将阴性样品与茵陈蒿汤物质基准的特征图谱相比较，并对峰进行归属。其中12个峰归属为茵陈、2个峰归属为栀子、7个峰归属为大黄，其余为共有峰。见图2。

注：(1)茵陈蒿汤物质基准；(2)大黄阴性样品；(3)栀子阴性样品；(4)茵陈阴性样品。图2 茵陈蒿汤物质基准归属峰结果

2.5.3 共有峰指认 根据茵陈蒿汤中化学成分，确认了8个特征峰，峰3为没食子酸、峰4为绿原酸、峰6为秦皮乙素、峰8为栀子苷、峰13为金丝桃苷、峰20为槲皮素、峰22为大黄酸、峰23为大黄素，见图3。

图3 茵陈蒿汤基准物质峰指认

2.6 特征峰选取及评价

结合茵陈蒿汤功效成分及峰的峰高、峰形等参数，选取了17个特征峰，见图4。其中峰1、2、3、5、7、8、9、11、12、13共计10个色谱峰来自于茵陈，占总峰数约58.8%；其中峰4、6共计2个色谱峰来自于栀子，占总峰数约11.8%；其中峰8、10、14、15、16、17共计6个色谱峰来自于大黄(其中峰8与茵陈共有)，占总峰数约47.1%。

图4 茵陈蒿汤基准物质特征图谱

根据特征峰的分离及保留时间情况，确定以绿原酸所对应的峰为S峰，并采用相对保留时间对茵陈蒿汤物质基准的特征图谱进行评价，即：供试品特征图谱应呈现17个特征峰，与绿原酸峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，规定值为0.49(峰1)、0.54(峰2)、1.07(峰4)、1.22(峰5)、1.66(峰6)、2.66(峰7)、2.91(峰8)、2.99(峰9)、3.29(峰10)、4.18(峰11)、4.29(峰12)、4.55(峰13)、5.16(峰14)、5.21(峰15)、5.63(峰16)、5.75(峰17)。

3 讨论

本文研究根据茵陈蒿汤处方的功效及各味药在处方中的作用，筛选出特征图谱研究的主要目标物质，在色谱条件及供试品溶液制备方法的选择时均对目标物质情况有针对性地进行了考察，进而建立了茵陈蒿汤物质基准的特征图谱。对峰进行归属，12个峰归属为茵陈、2个峰归属为栀子、7个峰归属为大黄。根据《伤寒论》中记载，茵陈蒿汤处方为：茵陈六两，栀子14枚，大黄二两[1]。其中茵陈用量最大、大黄次之、栀子最少，说明本研究特征图谱反映的成分数量符合茵陈蒿汤方剂特性。

对茵陈蒿汤基准物质的峰进行指认，确定包含绿原酸、秦皮乙素、栀子苷、没食子酸、大黄酸、大黄素、金丝桃苷、槲皮素等成分。其中茵陈主要的有机酸类成分为绿原酸，具有抗氧化、抗病毒、清除体内自由基以及保肝利胆的作用[13-14]；茵陈主要的香豆素成分为秦皮乙素，能够降低叔丁基过氧化氢诱导的肝脏病变的发生率，起到保肝作用[15]；栀子主要的环烯醚萜类成分为栀子苷，对四氯化碳引起的小鼠肝脏损伤具有显著的保护作用，明显抑制肝脏组织疤痕形成以及胶原沉积[9]；大黄主要的鞣质类成分为没食子酸，研究表明当质量浓度在50～400ug·mL-1范围内时，具有明显的清除一氧化氮、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基以及羟自由基的作用[16]；大黄主要的蒽醌类成分为大黄酸和大黄素[10]，具有泻下作用，同时也可以降低因四氯化碳所导致的肝损害；大黄主要的黄酮类成分为金丝桃苷和槲皮素，金丝桃苷能通过上调细胞抗氧化酶活性，增强肝细胞的抗氧化能力，从而保护肝细胞因脂质过氧化物而造成的损伤[17]，而槲皮素能够改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织脂肪变性程度，减轻肝脏炎症[18]。表明特征图谱反映的成分与茵陈蒿汤物质基准特征图谱目标物质的选择设计相符。

《注册管理规定》[2]中规定经典名方制剂应与其物质基准的关键质量属性一致，且经典名方物质基准应作为其复方制剂生产工艺路线制定、参数的优化和质量标准制定的参照。因此，制定特征图谱方法能够反映中药经典名方物质基准的功效，是对经典名方制剂减免药效及临床试验政策下临床疗效的保证。

本方法建立的茵陈蒿汤物质基准的特征图谱能够反映茵陈蒿汤药效，可为后续关于茵陈蒿汤制剂的开发及质量控制提供理论依据。