乳矿物盐的安全性与功能性评价

◎ 曹 亮，黄 莉

（东北农业大学，黑龙江 哈尔滨 150028）

乳矿物盐又称乳钙、乳清矿物质浓缩物、乳清钙，其以乳清为原料，经过纯化、超滤和干燥等工艺制成[1]。乳矿物盐含有磷酸钙、蛋白质、乳糖及锌、钠、钾、镁等丰富的营养成分，较利于人体吸收利用，作为一种新钙源被广泛应用[2]。

乳矿物盐因其独特的生理功能，其相关产品的开发应用前景必然广阔。因此，本文以大鼠和小鼠为研究对象，分别进行为期90 d和30 d的灌胃实验，分析乳矿物盐对大鼠食物利用率与大鼠胃、肠、脾、肝脏等组织病理学的影响。同时，分析乳矿物盐对小鼠免疫功能的影响，为其全面利用和开发乳矿物盐提供科学指导和理论依据，为开发功能保健食品提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳矿物盐由阿尔拉食品原料贸易（北京）有限公司（原丹麦阿拉食品原料有限公司北京代表处）提供，0525BG乳钙，乳白色粉状；体重65～80 g清洁级SD大鼠80只，雌雄各半，由军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（军）2012-0003；体重16～20 g清洁级昆明种小鼠200只，雌雄各半，由军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK-（军）2002-0001；饲料由军事医学科学院实验动物中心公司提供，许可证号：清洁级，SCXK-（军）2002-018。

注射用墨汁、刀豆蛋白A（ConA）、噻唑蓝（MTT）、2,4二硝基氟苯（DNFB）、丙酮、麻油、绵羊红细胞（SRBC）、生理盐水、鸡红细胞、、甲醇、Giemsa染色、YAC-1细 胞、Hanks液（pH=7.2～7.4）、RPM11640完全培养液、乳酸锂、碘硝基氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、Tris-HCL缓冲液（pH=8.2）、1% NP40、台酚兰、1 mol·L-1盐酸和酸性异丙醇等。

1.2 仪器与设备

SHANDON EXCELSIOR全自动密封脱水机；电热鼓风干燥箱；Olympus IX71倒置显微镜；8 mm直径打孔器；微量血凝试验板；2-16K通用离心机；RT-6100酶标仪；96孔培养板；Co-150 CO2培养箱；UV-1800紫外可见分光光度计；电子天平；显微镜。

1.3 受试样品及配制

乳矿物盐的成人日推荐量为2.4 g，即0.04 g·kg-1BW（成人体重以60 kg计）。安全性评价实验组按日推荐量的25倍、50倍、100倍配制受试样品浓度分别 为1.0 g·mL-1、2.0 g·mL-1和4.0 g·mL-1的 低、中、高剂量剂量组；功能性评价实验组按照乳矿物盐受试物成人日推荐量的5、10和30倍，设3个剂量组为0.2 g·mL-1、0.4 g·mL-1、1.2 g·mL-1；以去离子水作为对照组，临用前称取矿物质盐加去离子水至1.0 mL，混匀。

1.4 动物分组与给药

1.4.1 安全性评价实验组

参照《保健食品及其原料安全性毒理学检验与评价技术指导原则（2020年版）》，按性别随机分成4组、每组10只。试验设3个剂量组为1.0 g·kg-1BW、2.0 g·kg-1BW、4.0 g·kg-1BW，去离子水为空白对照。试验期间单笼喂养，自由进食饮水，室温为20～23 ℃，湿度为45%RH～52%RH，每天定点灌胃（上午8:00），连续灌胃90 d后，记录饲料撒漏量，每周记录一次体重和2次食物摄入量。喂养90 d后对肝、肾、脾、胃肠、睾丸和卵巢做病例学检查。

1.4.2 功能性评价实验组

200只小鼠随机分成5大组，再分成4小组，每小组10只小鼠，设3个剂量组为0.2 g·kg-1BW、0.4 g·kg-1BW、1.2g·kg-1BW，分别高、中、低剂量组，单笼喂养，室温为20～23 ℃，湿度为45%RH～52%RH，每天定点灌胃（上午8:00），连续灌胃90 d后，分别进行试验。

1.5 安全性评价实验组实验方法

对选取的安全性实验组的大鼠连续灌胃90 d，进行食物利用率、病理组织学检查。食物利用率公式如下：

1.6 功能性评价实验组实验方法

1.6.1 小鼠体重的测定标记每只小鼠，对小鼠定点测定体重，记录小鼠的初始体重和终期体重。

1.6.2 免疫器官系数

参照张勇[3]的实验方法。小鼠适应性喂养3 d，随机分成对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组，每组10只。按每日1mL·kg-1BW连续灌胃，连续30 d，末次给药6 h后，脱颈椎处死小鼠，称量小鼠体重，取腹腔液后，无菌分离肝脏和脾脏，称重。免疫器官系数计算如下：

免疫器官系数（g/g）=免疫器官重量/体重

1.6.3 碳廓清实验

末次给药6 h后，注射印度墨水并记时2 min、10 min，分别取内眦静脉丛血20 μL，并立即加入2 mL 0.1% Na2CO3溶液中，以Na2CO3溶液为空白对照，在600 nm处测定OD值，将小鼠处死后，取出肝脏、脾脏后称重，计算吞噬指数a：

1.6.4 抗体生成细胞检测

颈椎脱臼处死小鼠，取脾脏，经磨碎、过滤、离心，洗涤后悬浮于8 mL Hanks液中。取25 μL脾细胞悬液、50 μL 10% SRBC、0.5 mL 0.5%的琼脂糖Hanks液混合培养基迅速混匀，倾倒于6 cm已刷琼脂薄层的平皿上，于CO2培养箱中温育1.5 h，然后加入用SA缓冲液稀释的补体（1∶8），温育3 h后，计数溶血空斑数[4]。

1.6.5 血清溶血素的测定

将小鼠摘除眼球采血，2 000 r·min-1离心10 min进行血清的分离，用生理盐水稀释不同倍数并置于微量血凝板内，每孔100 μL，加入同体积的0.5%（v/v）的SRBC悬液，混匀，37 ℃温箱孵育3 h，观察血球凝集程度[5]。

1.6.6 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验

参照史顶聪等[6]的方法，并做适当修改，将上述细胞悬液经离心，调整浓度为3×106个/mL。分两孔加入24孔培养板中，每孔1 mL，一孔加75 μL ConA液，另一孔为对照，培养72 h。培养68 h时，每孔吸取0.7 mL上清液，并加入同体积不含小牛血清的RPMI 1640培养液与50 μL的MTT，继续培养。培养结束后，分装于96孔培养板，3个平行孔，于570 nm处测定OD值。

1.6.7 迟发型变态反应（DTH）检测

末次给药6 h后，对小鼠腹部皮肤约3 cm×3 cm进行脱毛处理，用50 μL的DNFB溶液涂抹均匀致敏；5 d后，再以10 μL的上述溶液均匀涂抹小鼠右耳。24 h后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳，用打孔器取下直径8 mm的耳片称重，按下列公式计算左右耳肿胀度差[7]：

左右耳肿胀度差=右耳重量-左耳重量

1.6.8 小鼠腹腔巨噬鸡红细胞实验（半体内法）

腹腔注射1 mL 20%鸡红细胞悬液。30 min后，颈椎脱臼处死动物，固定在鼠板上剪开腹壁皮肤，经腹腔注入2 mL生理盐水，转动鼠板1 min。吸出1 mL腹腔洗液，滴于2片载玻片上，移置37 ℃温育30 min。生理盐水漂洗、晾干、固定、染色、蒸馏水漂洗晾干。在油镜下阅片计数，计算吞噬率和吞噬指数。

1.6.9 小鼠NK细胞活性测定（乳酸脱氢LDH测定法）

参照Cao等的方法[8]，试验前24 h将靶细胞传代培养，Hanks液洗3次，RPMI1640培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。经离心、稀释、染色，调整细胞浓度为2×107个/mL。取靶细胞和效应细胞各100 μL（效靶比为50∶1），于37 ℃、5% CO2培养箱中培养4 h，然后将培养板离心（1 500 r·min-1）5 min，每孔吸取上清液100 μL置于96孔培养板中，并加入同体积的LDH基质液，反应3 min，每孔加入30 μL 1 moL·L-1的HCL，于490 nm处测定OD值。

1.7 数据处理

所有试验的平行试验次数至少3次。实验数据以SPSS软件进行单因素方差分析。经方差齐性检验，方差齐的实验数据采用LSD法进行统计分析，方差不齐的实验数据采用Tamnane法进行统计分析。当概率值≤0.05时，判定为统计学显著。

2 结果与分析

2.1 乳矿物盐的安全性分析

2.1.1 对大鼠食物利用率的影响

表1 为乳矿物盐对大鼠食物利用率的影响，由表1可知，随着灌胃时间的增加，各剂量组的食物利用率整体呈降低趋势，雄性大鼠的食物利用率普遍高于雌性大鼠的食物利用率。雄性大鼠的食物总利用率在34%左右，而雌性大鼠的食物总利用率在24%左右，与同性别同时期的对照组比较，大鼠的食物利用率无显著差异，说明乳矿物盐对大鼠的食物利用率无影响。

表1 乳矿物盐对大鼠食物利用率的影响表（单位：%）

2.1.2 乳矿物盐对大鼠病理组织学的影响

经观察各剂量组大鼠未发现明显病变，且生化指标未见异常，因此仅针对对照组及高剂量进行组织病理学检查。表2为大鼠胃、肠、脾、卵巢和睾丸病理检测结果，表3为大鼠肝脏与肾脏病理检测结果，由表2、表3可知，正常肝小叶结构存在，肝细胞无明显肿胀及颗粒变性，个别肝细胞浆内出现少许细小的脂肪空泡，呈轻度脂肪变，脂肪变干细胞呈散在小灶分布，范围小。干细胞无坏死改变，少数肝小叶、肝汇管区见淋巴细胞等炎细胞浸润，无纤维组织增生，胆管未见异常；胃和十二指肠黏膜完整，无明显出血、坏死、糜烂、溃疡及炎细胞浸润，无明显腺体增生萎缩改变；肾皮髓质结构清楚，肾小管无明显肿胀及空泡变性，个别肾间质中有灶性炎细胞浸润，个别肾髓质部可见小囊肿；脾白髓、红髓结构清楚，白髓、红髓无明显扩张或萎缩现象；睾丸曲细精管正常，可见各级生精细胞及成熟精子；卵巢发育正常，可见各级卵泡和成熟黄体。综合可知，以上病理学改变仅个别动物中发生，各组标本病理变化无明显差异，因此，乳矿物盐对各脏器未引起病理学改变。

表2 大鼠胃、肠、脾、卵巢和睾丸病理检测的结果表

表3 大鼠肝脏与肾脏病理检测结果表（单位：例）

2.2 乳矿物盐的功能性分析

2.2.1 对小鼠体重的影响

图1 为乳矿物盐对小鼠体重的影响，由图1可知，与对照组比较，高、中、低剂量组小鼠的体重均无显著差异（P＞0.05），说明了乳矿物盐对小鼠体重无影响。

图1 乳矿物盐对小鼠体重的影响图

2.2.2 对小鼠免疫器官系数的影响

正常情况下，健康小鼠的各脏器与体重的比值相对恒定。当动物染毒后，会引起受损脏器重量发生改变，从而引起脏体比的变化。表4为各剂量组胸腺指数、脾指数的测定结果，由表4可知，与对照组比较，高、中、低各剂量组均无显著差异（P＞0.05）。从统计学方法分析说明了乳矿物盐对小鼠的免疫器官指数无影响，未能促进免疫器官的增长。

表4 胸腺指数、脾指数的测定表

2.2.3 细胞免疫功能测定

表5 为ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验与迟发型变态反应实验结果，由表5可知，与对照组比较，低剂量组小鼠淋巴细胞转化OD值差异不显著（P＞0.05），而中剂量组和高剂量组小鼠淋巴细胞转化OD差值明显高于对照组，差异显著（P＜0.05）。中剂量组与高剂量组小鼠左右耳肿胀度明显高于对照组，差异显著（P＜0.05），而低剂量组与对照组相比，差异不显著（P＞0.05）。说明乳矿物盐具有增强细胞免疫的功能。

表5 细胞免疫功能测定表

2.2.4 体液免疫功能测定

表6 为血清溶血素与抗体生成细胞检测实验结果，由表6可知，各剂量组小鼠抗体积数与对照组比较，差异均不显著（P＞0.05）。与对照组比较，高剂量组的溶血空斑数具有显著的差异（P＜0.05），中、低剂量组与对照组比较，差异不显著（P＞0.05）。

表6 体液免疫功能测定表

2.2.5 单核-巨噬细胞功能测定

表7 为小鼠的碳廓清试验与巨噬细胞吞噬试验结果，由表7可知，高、中、低各剂量组小鼠碳廓清吞噬指数a与对照组比较，差异均不显著（P＞0.05）。高、中、低各剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率、转换值及吞噬指数与对照组比较，差异不显著（P＞0.05）。

表7 单核-巨噬细胞功能测定表

2.2.6 NK细胞活性测定

表8 为NK细胞活性测定结果，由表8可知，低剂量组、中剂量组与高剂量组小鼠NK细胞活性明显高于对照组，差异显著（P＜0.05）。NK细胞活性测定结果为阳性，提示乳矿物盐可以增强机体免疫功能。

表8 NK细胞活性测定表

3 结论

乳矿物盐营养成分丰富，是公认的优质有机钙源，易于人体吸收，有利于身体健康。本研究经90 d实验发现，与对照组比较，各剂量组对大鼠的食物利用率均无统计学意义（P＞0.05）。同时，乳矿物盐高剂量组对大鼠的胃、肠、脾、卵巢、睾丸、肝脏以及肾脏等器官均未引起病理学反应，说明乳矿物盐对大鼠身体无不良影响，食用安全性较高；经功能性实验发现，乳矿物盐对小鼠的体重、免疫器官系数与体液免疫功能均无显著影响，但对小鼠的细胞免疫功能和NK细胞活性等指标影响显著。根据《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）的规定，说明乳矿物盐具有提高人体免疫功能的作用，为其在食品、保健食品中的开发应用提供理论依据。