HPLC法测定丹参-红花配方颗粒中5种成分的含量

杜少兵，王鹏飞，白吉庆，周慧慧，薛志鹏，高 速，李 菁，王小平，2

（1.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712046）

丹参为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhizaBge.）的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，性微寒，味苦，归心、肝经，具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈，除烦安神的功效［1］。红花为菊科植物红花（Carthamus tinctoriusL.）的干燥管状花，始载于《开宝本草》，味辛微苦、性温，具有活血通经、祛瘀止痛、解毒的功效，用于经闭、痛经、恶露不行、癥瘕痞块、胸痹心痛等症［2］。丹参-红花药对是经典的活血化瘀相须药对，两药配伍使用，一升一降，内外通和，使行气活血之功尤为显著。有文献表明，二药合用祛瘀生新，除邪而不伤正，共奏活血通络、祛瘀生新之功［3-4］。临床上广泛用于冠心病、心绞痛、心肌梗死、心肌缺血等心血管疾病［5-7］，且疗效确切［8-10］。

中药配方颗粒是以符合规范的中药饮片为主要原材料，利用现代化技术对有效成分进行提取、分离以及浓缩，之后进行干燥处理、制成供中医临床配方使用的颗粒，具有便于调配、免煎、易服、携带方便、剂量准确等特点［11］。丹参-红花配方颗粒的文献研究较少，缺乏质量控制与评价的方法。基于此，本试验建立HPLC法测定丹参-红花配方颗粒中5种（丹参素、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B）主要活性成分含量，为丹参-红花配方颗粒的多指标质量控制和全面的质量评价提供科学数据。

1 仪器、试剂与试药

1.1 仪器

Dionex Ultimate3000高效液相色谱仪（上海赛默飞世尔仪器有限公司）；Discovery DV215CD电子分析天平（瑞士赛多利斯集团）；Direct-Q 3UV纯化水机（美国Millipore公司）；SFY-20A卤素快速水分测定仪（苏州市莱顿科学仪器有限公司）；KQ-300VDE超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；HX-25电子恒温不锈钢水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）。

1.2 试剂与试药

丹参采自山东省菏泽市鄄城县，红花采自新疆维吾尔自治区塔城市裕民县，经陕西中医药大学白吉庆副教授鉴定均为正品。丹酚酸B对照品（批号：111562-201716，质量分数≥99.8%），羟基红花黄色素A对照品（批号：111637-201810，质量分数≥93.1%）购自中国食品药品检定研究院；丹参素对照品（批号：DST170420-015，质量分数≥98.0%）购自成都德思特生物技术有限公司；紫草酸对照品（批号：19053003，质量分数≥99.8%）购自森岚科技有限公司；迷迭香酸对照品（批号：BZP0004，质量分数≥98.0%）购自江西佰草源生物科技有限公司；乙腈（色谱纯），美国默克公司；其他试剂均为分析纯；水为超纯水（自制）。

2 方法

2.1 丹参-红花配方颗粒样品的制备

取丹参30 g，加320 mL水浸泡60 min，加入红花10 g，温浸120 min，放至室温，过滤，滤渣加8倍量的水温浸提取2次，每次120 min，滤液合并减压浓缩后干燥，得干浸膏粉，粉碎过3号筛，以干浸膏粉-糊精（1：1，m/m）混匀，70%乙醇为润湿剂，湿法制粒，整粒，即得丹参-红花配方颗粒（20190808、20190822、20190830）。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：A为乙腈，B为0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱（0～15 min，5%A；15～40 min，5%～10%A；40～130 min，10%～20%A；130～150 min，20%～23%A）；柱温25℃；检测波长288 nm；流速1 mL/min；进样量为5μL。

2.2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取丹参素0.84 mg、羟基红花黄色素A 0.67 mg、迷迭香酸0.58 mg、紫草酸0.36 mg、丹酚酸B 3.15 mg，置同一100 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取本品颗粒适量，研细，精密称取0.1 g的粉末，置锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，称定质量，超声处理5 min。取出，放冷，加水补充减失质量，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。

2.2.4 系统适用性试验

分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各5μL，按拟定色谱条件测定，记录色谱图。

2.2.5 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液1，2，5，8，10μL，按拟定色谱条件，注入液相色谱仪，记录各对照品的峰面积。

2.2.6 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液3μL，按拟定色谱条件，连续进样6次，记录各待测成分的峰面积。

2.2.7 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液3μL，按拟定色谱条件，分别于0、1、2、4、8、12、24 h进行测定，记录各待测成分的峰面积。

2.2.8 重复性试验

取同一批号样品6份，按照“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液，按拟定色谱条件测定，各待测成分的峰面积，代入工作曲线计算其含量，以各成分含量的RSD值来评价方法的重复性。

2.2.9 加样回收率试验

取已知含量同一批号的丹参-红花配方颗粒0.05 g，平行6份，分别精密加入适量的丹参素、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品，按“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液，按拟定色谱条件测定，计算加样回收率。

2.2.10 样品的测定

分别称取丹参-红花颗粒3批适量，按“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液，按拟定色谱条件，进样3 μL，记录丹参素、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B的峰面积，计算其含量。

3 结果

3.1 系统适用性试验

结果显示供试品色谱图中，在与对照品色谱图丹参素（峰1）、羟基红花黄色素A（峰2）、迷迭香酸（峰3）、紫草酸（峰4）及丹酚酸B（峰5）相应位置上，均有相同保留时间，各成分的分离度均大于1.5，理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于6000，见图1。

图1 混标溶液和丹参-红花配方颗粒HPLC色谱图Fig.1 HPLCchromatogramsof mixed standard solution and Danshen-Honghua dispensing granule

3.2 线性关系考察

以对照品进样量（ng）为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归。线性关系结果见表1，结果表明各待测成分在试验浓度范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Table 1 Linear relationships of various constituents

3.3 精密度试验

丹参素、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B峰面积的RSD（n=6）分别为2.55%、1.55%、2.74%、1.79%、1.77%，表明该仪器的精密度良好。

3.4 稳定性试验

丹参素、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B峰面积的RSD（n=6）分别为2.30%、2.49%、2.13%、2.74%、1.31%，表明供试品溶液中各待测成分24 h内基本稳定。

3.5 重复性试验

丹参素、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B峰面积的RSD（n=6）分别为1.76%、1.50%、2.82%、2.75%、1.33%，表明该方法重复性良好。

3.6 加样回收率试验

由表2可知，该方法的回收率良好，表明试验结果可靠。

表2 加样回收率试验结果（n=6）Table 2 Results of recovery test

3.7 样品的测定

样品中丹参素、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B含量测定结果见表3。

表3 样品含量测定结果（mg/g）Table 3 Determination of five components in the sample

4 讨论

现代研究表明，丹参的主要活性成分为亲水性成分（丹参素、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B）和亲脂成分［12］。而红花的主要活性成分是查耳酮类化合物红花黄色素，其中羟基红花黄色素A是活性较高的成分［13］，其具有抗氧化、抗血栓、神经保护、抑制炎症因子的产生等药理作用，而且可以改善因脑缺血再灌注引起的脑损伤［14-16］。所以本试验选择这5种活性成分为评价指标，为丹参-红花配方颗粒质量控制与评价提供参考。

本试验采用二极管阵列检测器对其进行全波长扫描，结果表明丹参素、紫草酸、迷迭香酸的最大吸收波长为280 nm，丹酚酸B的最大吸收波长为286 nm，羟基红花黄色素A的最大吸收波长为403 nm，考察了不同波长下各成分的吸收情况，发现各成分在288 nm处均有中强吸收，基线稳定，所得各个色谱峰的峰面积较高，且色谱峰分离度较好，故选用288 nm为检测波长，便于该方法的广泛地应用。本试验考察乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液、甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水溶液等流动相系统，结果显示以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相，峰形较对称。通过对乙腈-0.2%磷酸水溶液流动相的洗脱方式进行比较，发现等度洗脱无法得到较好的分离度，故最终选用梯度洗脱。

本试验以丹酚酸B、丹参素、紫草酸、迷迭香酸和羟基红花黄色素A为指标，建立了HPLC法测定丹参-红花配方颗粒中这5种成分的含量。该方法简便、高效、准确、重复性好，对丹参-红花配方颗粒进行了一定程度的质量研究，为其后续研究提供技术参考。