醋制对南五味子抗CCl4致急性肝损伤大鼠的影响

姜海慧，张 婷，张化为，姜 祎，宋小妹，2，黄文丽，邓 翀*

（1.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712046）

南五味子为木兰科华中五味子（Schisandra sphenantheraRehd.et Wils）干燥成熟果实，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效，用于治疗久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、津伤口渴、内热消渴及心悸失眠等［1］。据文献报道，南五味子对肝损伤保护和修复研究较多［2-4］。在“醋制入肝”［5］中药炮制理论指导下，本研究以CCl4致大鼠急性肝损伤为模型，比较南五味子醋制前后对肝脏保护和肝损伤修复差异，为探讨醋制南五味子修复肝损伤原理提供依据和参考。

1 材料与仪器

1.1 药物与试剂

南五味子采购自陕西省商洛市商州区，经陕西中医药大学药学院姜祎副教授鉴定为木兰科华中五味子的干燥成熟果实。联苯双酯滴丸（万邦德制药集团股份有限公司，1.5 mg/丸，批号20190724）。CCl4（成都科龙试剂厂，纯度≥98%，批号20190724）；乌来糖（中国国药集团化学试剂有限公司，纯度≥98%，批号WS20170411）；其余试剂均为分析纯。ALT（批号20190510）、AST（批号20190822）、MDA（批号20190912）、GSH（批号20190506）、SOD（批号20190423）、HE（批号20190713）试剂盒购于南京建成生物工程研究所；HIF-1α（批号60441）、NF-κB p65（批号07C14B）均购自武汉生物工程有限公司；米醋（山西水塔老陈醋股份有限公司，批号20190602）。

1.2 试验动物

SD大鼠，雌雄各半，7～8周龄，清洁级，体重200±20 g，购自成都达硕实验动物有限公司，合格证号SCXK（陕）2019-010，实验动物通过陕西中医药大学伦理委员会批准，饲养和实验操作均符合动物实验管理条例的要求。

1.3 主要仪器

UV1102紫外分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；GB2042电子天平（赛多利斯贸易有限公司）；RE52-05旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；TGL-16G离心机（上海安亭科学仪器厂）；ELX-808型自动酶标仪（美国宝特公司）。

2 方法

2.1 供试样品制备

分别称取醋制前后南五味子粉末各2 kg，以16倍体积55%乙醇回流提取2次，提取时间60 min。旋转蒸发仪减压浓缩提取液，浓缩浸膏经烘箱60℃干燥，最后得到干膏。分别称取一定量南五味子醋制前后醇提取物，以0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）溶液溶解，制备不同给药剂量灌胃药液。

2.2 实验方案

将90只SD大鼠随机分为9组，每组10只，分别是空白对照组（CMC-Na溶液），模型对照，阳性对照组（联苯双酯滴丸，3.75 mg/kg），醋制前五味子大、中、小剂量，醋制后五味子大、中、小剂量（各组的给药剂量以生药量计算分别为5 g/kg体重、2.5 g/kg体重、1.25 g/kg体重）。正常对照组和模型组用等体积的0.5%CMC-Na溶液灌胃，每日1次，共10 d。末次给药后2 h，正常对照组除外，其余各组腹腔注射1 mL/kg CCl4。另外空白对照组和模型组组给予相应剂量的CMC-Na溶液，阳性对照组给药剂量为100 mg/kg。

2.3 组织标本的采集及处理

造模后大鼠禁食不禁水12 h后，腹主动脉取血并静置1 h，以3000 r/min离心10 min，分离血清，-80℃的冰箱中保存备用。取动物的肝脏组织（均取同一部位），以适量生理盐水清洗血污，部分肝组织于-80℃贮存备用待测，部分肝组织以10%甲醛固定。参照试剂盒说明测定血清中AST、ALT活力；参照试剂盒说明测定不同实验组别肝脏中的GSHPx、MDA、SOD含量；甲醛固定肝组织，HE染色组织形态学观察；免疫组化染色（结合生化指标和一般病理切片实验结果，免疫组化染色只针对大剂量组），观察染色表达情况。

2.5 统计学处理

以SPSS25.0软件分析数据，以不同观察的实测值进行组间比较，以P＜0.05表示组间具有显著差异性，以P＜0.01表示组间具有非常显著差异性。

3 结果

3.1 药物对四氯化碳致急性肝损伤大鼠血清ALT、AST含量的影响

与对照组相比，模型组中ALT和AST水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较联苯双酯组、炮制前高剂量组及醋制后低、中、高剂量组中ALT和AST水平显著降低（P＜0.01），醋制前中、低剂量组中ALT和AST水平降低（P＜0.05）；与醋制前大剂量相比，空白组、联苯双酯组、醋制后大剂量组、醋制后中剂量组、联苯双酯组中ALT和AST水平显著降低（P＜0.01或P＜0.05），但醋制后高剂量组与联苯双酯组差异不明显。结果见表1。

表1 南五味子醋制前后对CCl4致急性肝损伤大鼠血清ALT、AST含量的影响Table 1 Effects of S.sphenanthera vinegar on serum ALTand ASTlevels in rats with acute liver injury induced by CCl4

3.2 药物对动物肝脏中GSH-Px、MDA、SOD含量影响

与对照组相比，模型组中GSH-Px、SOD水平显著降低（P＜0.01），MDA水平显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，联苯双酯组、醋制前低、中、高剂量组及醋制后低、中、高剂量组中GSH-Px、SOD水平显著升高（P＜0.01），MDA水平显著降低（P＜0.01）；与醋制前大剂量相比，空白组、醋制后大剂量组中GSHPx、SOD水平显著升高（P＜0.01），但炮制后高剂量组与联苯双酯组差异不明显。结果见表2。

表2 南五味子醋制前后对大鼠肝组织中SOD、GSH及MDA的影响Table 2 Effects of S.sphenanthera vinegar on SOD，GSH and MDA in liver tissues of rats

3.3 药物对大鼠肝组织病理学变化影响

醋制南五味子对大鼠肝组织病理学变化影响结果见图1。如图1A所示，在组织形态学光镜下，空白对照组肝细胞边缘完整，排列规则；如图1B所示，模型组肝组织病变明显，肝小叶结构存在，各动物均见以小叶中心为主的不同程度的肝细胞空泡变性及气球样变，重者其间见肝细胞坏死表达，且雌性组比雄性组更为严重；如图1C所示，南五味子给药组及阳性对照组与模型组相比，肝组织病变明显减轻，其中阳性对照5只动物恢复正常，4只仍有轻微损伤，未见重度损伤的病理改变，这表明阳性药联苯双酯抗肝损伤效果明显；图1D至1I表明醋制五味子各剂量给药组对肝组织病变改善程度明显优于其生品各剂量组，醋制南五味子各给药剂量组对肝组织病变改善程度以高剂量组最为明显。

图1 醋制南五味子对CCl4致急性肝损伤肝脏组织形态学图Fig.1 Histomorphology of the liver histomorphology of the acute liver injury induced by CCl4 caused by vinegar-made S.sphenanthera

3.4 药物对大鼠肝组织NF-κBp65蛋白表达水平的影响

醋制五味子对CCl4致急性肝损伤大鼠肝组织NF-κB免疫组化结果的影响如图2所示。结果表明，NF-κBp65免疫反应阳性细胞多存在于肝静脉周围，棕黄色阳性染色颗粒主要表现在细胞核；图2A表明正常组染色未见免疫反应阳性细胞；图2B表明模型组阳性细胞染色加深，阳性表达分布密集；图2C表明生品组阳性细胞数目减少及染色变浅，阳性表达稀疏分布；图2D表明醋制南五味子组阳性棕黄色颜色较浅，少有分布。由此可见，南五味子对大鼠损伤肝组织中NF-κBp65蛋白表达具有调节作用，其中醋制南五味子对NF-κB p65蛋白表达调节强于南五味子生品。

图2 大鼠肝脏NF-kBp65蛋白免疫组化图Fig.2 Immunohistochemical map of NF-kBp65 protein in rat liver

3.5 药物对大鼠肝组织HIF-1α蛋白表达水平的影响

醋制五味子对CCl4致急性肝损伤大鼠肝组织HIF-1α免疫组化结果的影响如图3所示。图3A表明正常对照组的小鼠肝脏HIF-1α表达阴性，整体颜色较浅；图3B表明CCl4急性肝损伤组小鼠肝脏HIF-1α主要在肝静脉周围损伤细胞中有强阳性表达，整体棕黄色表达颜色较深；图3C表明南五味子生品预处理组肝脏HIF-1α阳性的细胞数量相比模型组阳性表达显著减少，主要分布在肝静脉周围细胞有显著减少；图3D表明醋制五味子预处理组肝脏HIF-1α阳性的细胞数量相比模型组阳性表达减少，棕黄色阳性表达颜色很浅，主要分布在肝静脉周围细胞。可见，南五味子对大鼠肝组织HIF-1α蛋白表达具有调节作用，其中醋制南五味子对调节能力优于南五味子生品。

图3 大鼠肝脏HIF-1α蛋白免疫组化图Fig.3 Immunohistochemical map of HIF-1αprotein in rat liver

4 讨论

CCl4在肝细胞P450酶系作用下产生一系列自由基从而引起氧化应激及脂质过氧化的连锁反应，损伤细胞膜的结构和功能，导致肝细胞坏死［6-7］。当机体内氧自由基的动态平衡被打破，产生过多的自由基，抗氧化物质SOD、GSH等被大量损耗，从而形成脂质过氧化反应的终产物MDA［8-9］。MDA的水平可反映机体内脂质过氧化的程度，并可以反映机体细胞受自由基攻击的严重程度。血清中ALT、AST水平反映了肝细胞受损的程度［10］，因此本研究选用ALT、AST指标来反映肝损伤。

另一方面，HIF-1α是调节氧稳态平衡的主要调节因子，HIF-1α缺氧感受途径通过不同的机制在不同的环节直接或间接参与了对免疫反应的调控，并且在此过程中发挥了重要的作用。在缺氧条件下可能存在“炎症-炎性介质-HIF-1α-炎症”的正反循环，HIF-1α起着炎症放大的作用［11］。核因子-κB（NF-κB）通路在各种因素导致的急性肝损伤过程中扮演了重要的角色［11-12］。HIF参与组织/细胞中氧含量变化介导各种生理/病理变化的调节，HIF-1α能够激活与无氧酵解相关基因p53的表达；而NF-κB在多种细胞类型中也能应答缺氧而被激活，从而进一步参与组织/细胞中对炎症的调控。NF-κB调控HIF因子的转录，而HIF-1α调节NF-κB信号的转导。HIF-1α和NF-κB在缺氧性炎症中具有紧密的相互依赖性调控作用［13-14］。

本研究结果表明，南五味子醋制前后均能降低CCl4致小鼠急性肝损伤血清ALT、AST的升高，降低肝匀浆中MDA含量，增强GSH-Px、SOD的活性，抑制肝细胞中NF-KBP65和HIF-1α表达，减轻CCl4对肝组织的病理损伤。其中，醋制南五味子对大鼠体内ALT、AST、GSH-Px、SOD紊乱状态调节更为明显，在抑制肝细胞中NF-KBP65和HIF-1α表达和减轻CCl4对肝组织的病理损伤效果更为显著。醋制过程增强了南五味子对CCl4致大鼠机体氧化应激及脂质过氧化状态的调节，这为进一步阐明醋制南五味子降酶保肝的作用机理提供实验依据。