基于GC-TOF/MS的卷柏不同生长阶段代谢组学研究

席彩彩，谷 巍,2*，周 晨，张阿琴，王 帆

(1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；2.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023)

卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)spring为蕨类卷柏科卷柏属植物，在我国各地均有分布，具有破血散瘀、活血止血的功能[1-3]。卷柏是典型极端耐旱的复苏维管植物，干旱时植株向内卷成一团，颜色枯黄，但它能在相当长时间里保持生命，一旦遇水，便会植株伸展返绿，因此民间常称其为“九死还魂草”[4-5]。对于卷柏的形态及产地最早记载见于《名医别录》，它喜光，多生于向阳的山坡岩石上或干旱的岩石缝中，在温度20 ℃左右的潮湿地方生长正常[6-7]。全年均可采收[8]，采收期区别于古籍记载。

中药质量的优劣取决于有效成分的含量，后者会随生长过程发生不同程度的动态变化，因此适时采收是保证中药材质量的先决因素之一[9]。卷柏化学成分复杂多样，目前对其成分的测定方法大多为GC-MS、HPLC、TLC等，仅局限于某几个特征成分，忽略了其他成分的变化。代谢组学从植物生物体系的整体性和动态性出发，研究植物代谢产物的动态变化，不仅可以观察到化学成分的积累过程，还可以发现各成分之间的相互转化规律，可从整体上科学评价药材的质量[10-12]。

本研究借鉴植物代谢组学的思路和方法，研究三个不同生长阶段卷柏样品的代谢产物的不同，寻求差异化合物，探究其动态变化，采用肟化-硅烷化衍生法GC-TOF/MS技术分析卷柏三个不同生长阶段样品的化学成分，并通过主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)进行数据处理，找出差异显著的化学成分及其变化规律，为卷柏商品药材质量的综合评价及卷柏药材的采收提供参考，为卷柏复苏机制研究提供依据，为其综合开发利用奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 ALEX-CIS GCTOF-MS气质联用仪(美国Leco公司)；MIKRO220/220R型离心机(德国Hettich公司)；AX324ZH型电子分析天平(美国Ohaus公司)；移液枪(德国Eppendorf公司)；微型旋涡混合器(德国BOECO公司)。

1.2 试剂与药物 甲氧胺盐酸盐(CH3ONH2·HCl)、饱和脂肪酸甲酯、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺、吡啶均为色谱纯购自美国Sigma-Aldrich公司；其余试剂均为分析纯；水为蒸馏水。卷柏全草分别于2014年5月、2014年9月、2015年1月采自江苏省连云港前云台、中云台、后云台山，每个生长期采集3批，经南京中医药大学中药资源教研室谷巍教授鉴定为卷柏科植物卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)spring，除去须根洗净晒干备用，保存于南京中医药大学药学院，具体信息见表1。

表1 样品信息

2 方法

2.1 分析条件

2.1.1 色谱 rtx5Sil-MS型毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；载气高纯氦气(99.999%)；体积流量为1 mL/min；程序升温(50 ℃保持1 min，以20 ℃/min 升至330 ℃，保持5 min)；进样口温度50 ℃，以12 ℃/s升至250 ℃；进样量0.5 μL；不分流，无溶剂延迟。

2.1.2 质谱 电子电离源(EI)；检测器电压1 800 V；传输线温度230 ℃；离子源温度250 ℃；质量扫描范围m/z80～500；电子能量为70 eV。

2.2 供试品溶液制备 取不同生长阶段、批次卷柏2 g粉碎，加入10 mL乙腈-异丙醇-水(3∶3∶2,脱气，-20 ℃)超声提取2次，每次30 min，涡旋10 s，在4 ℃下振摇5 min，离心，移出上清液，冻干，经乙腈-水(3∶1)萃取，离心，取上清液浓缩。采用肟化-硅烷化衍生法，向样品中加入2 μL C8～C30脂肪酸甲酯标准混合液(溶于氯仿，C8～C160.8 mg/mL，C18～C300.4 mg/mL)，加入40 μL新鲜配制的20 mg/mL甲氧胺吡啶盐酸溶液，在30 ℃下反应90 min，750 r/min快速搅拌，发生肟化反应，最后加入40 μLN-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺，750 r/min快速搅拌，在37 ℃下反应50 min，实现活泼氢的三甲硅烷基化作用[13]，放冷，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.3 方法学考察 精密吸取同一供试品溶液，在“2.1”项条件下进样测定6次，于0、4、8、12、24 h进样检测；按“2.2”项下方法平行衍生化制备6份供试品溶液，在“2.1”项条件下进样测定，计算各主要色谱峰相对内标的保留时间和峰高RSD，考察仪器精密度、供试品溶液的稳定性、样品制备重复性。

3 结果

3.1 方法学考察 主要色谱峰相对保留时间和相对峰高RSD均小于2%，表明仪器精密度良好，溶液在24 h内稳定，方法重复性理想。

3.2 GC-TOF/MS分析 共检测出代谢产物441个，鉴定出化合物182个，见表2。

表2 GC-TOF/MS分析结果

3.3 多元统计分析

3.3.1 主成分分析 采用PCA多变量模式识别方法[14]，对3个生长阶段样品数据进行降维分析，其得分图(t[1]56.5%，t[2]30.8%)见图1。由此可知，不同生长阶段样品数据分布在不同区域，分类结果较为理想，表明其成分存在明显差异；样品在PCA轴上呈现逐步变化的趋势，5月采收的分布在PC1轴正方向，9月、1月采收的分布在PC1轴负方向，各自聚为一类，表明5月采收的在代谢组成上与9月、1月采收的有明显不同。

3.3.2 偏最小二乘法判别分析 对3个生长阶段样品数据进行PLS-DA分析[15](5月与9月、5月与1月、9月与1月)，结果见图2a、2c、2e，可知每2组样品数据分别沿PC1轴明显分开，其中模型参数R2X(cum)分别为0.946、0.901、0.897；R2Y(cum)分别为0.999、0.999、0.998；Q2分别为0.998、0.997、0.995，表明模型有效可靠，与无监督的主成分分析(PCA)相比，2个生长期的样品数据得到了更大程度的分离，有助于寻找差异性成分。VIP得分图见图2b、2d、2f，可知对2组分类贡献较大的差异性成分(VIP>1)分别有23、26、25个特征峰。

3.4 差异性成分分析

3.4.1 定性鉴定 将PLS-DA分析结果得到的3组对分类贡献较大的差异性成分进行比对，得到15个共有差异性成分，见表3。

表3 样品中共有差异性成分

注：A为5月，B为9月，C为1月。图1 不同采收期样品的PCA得分图

注：A为5月，B为9月，C为1月。图2 样品数据的PLS-DA得分图、VIP得分图

3.4.2 相对含量 提取各共有差异性成分在各组样品间对应的相对峰高来表示其相对含量，对同一化学成分在不同生长阶段样品间相对峰高平均值的标准差进行计算，结果见图3。由此可知，5月采收的样品中相对含量最高的化合物有7个，分别为海藻糖、硬脂酸、麦芽糖、甘油、赤藓糖醇、棕榈酸、甘露醇；9月采收的样品中相对含量最高的化合物有6个，分别为天冬氨酸、柠檬酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、焦谷氨酸、色氨酸；1月采收的样品中相对含量最高的化合物有2个，分别为蔗糖和丙氨酸，即5月采收的样品差异性成分数量最多。

注：a为海藻糖，b为天冬氨酸，c为柠檬酸，d为谷氨酰胺，e为硬脂酸，f为鸟氨酸，g为麦芽糖，h为甘油，i为赤藓糖醇，j为焦谷氨酸，k为色氨酸，l为蔗糖，m为棕榈酸，n为甘露醇，o为丙氨酸。A为5月，B为9月，C为1月。图3 不同生长阶段样品中差异性成分相对含量

3.4.3 显著性检验及代谢通路分析 5月、9月采收的样品中，海藻糖、天冬氨酸、柠檬酸、谷氨酰胺、硬脂酸、鸟氨酸、麦芽糖、甘油、赤藓糖醇、焦谷氨酸、色氨酸、棕榈酸含量有显著差异(P<0.01)；5月、1月采收的样品中，海藻糖、天冬氨酸、柠檬酸、谷氨酰胺、硬脂酸、鸟氨酸、麦芽糖、赤藓糖醇、焦谷氨酸、色氨酸、棕榈酸、甘露醇、丙氨酸含量有显著差异(P<0.01)；9月、1月采收的样品中，天冬氨酸、柠檬酸、谷氨酰胺、焦谷氨酸、色氨酸、棕榈酸、丙氨酸含量有显著差异(P<0.01)；天冬氨酸、柠檬酸、谷氨酰胺、焦谷氨酸、色氨酸、棕榈酸含量在不同生长阶段样品中均有显著差异(P<0.01)。

采用MetaboAnalyst 4.0 数据库对天冬氨酸、柠檬酸、谷氨酰胺、焦谷氨酸、色氨酸、棕榈酸进行代谢通路分析，结果见图4(图中每个圆圈代表一条代谢通路，圆圈颜色表示P值大小，颜色越红其P值越小，显著性越高，其对应的-logP值越大；圆圈的大小则表示该代谢通路的影响力大小，圆圈越大，说明它的影响力越大)，将代谢途径的影响得分大于0.05、P值小于0.05设为权重影响筛选标准[16-17]。由此可知，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢，二羧酸代谢，柠檬酸循环(TCA循环)，色氨酸代谢受影响较大，以丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢更明显。

注：A为氨酰-tRNA生物合成，B为丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，C为甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，D为精氨酸和脯氨酸代谢，E为吲哚生物碱的生物合成，F为赖氨酸生物合成，G为二羧酸代谢，H为柠檬酸循环，I为色氨酸代谢。图4 代谢通路代谢得分总图

4 讨论

卷柏代谢物繁杂，包含黄酮、炔酚酮、酚酸类等较强极性非挥发性代谢物，本实验选用肟化-硅烷化衍生法将卷柏代谢物中非挥发性成分经过衍生化后成为具有挥发性的成分，克服了传统GC-MS只能测定挥发性成分的缺陷。选用GC-TOF/MS分析，为全扫描质谱，每一个采集到的数据点都有一张完整的质谱与之对应。与四级杆质谱相比，飞行时间质谱可以检测到更多挥发性化合物，灵敏度高，因此用该方法常可以检测到特殊的或不常见的代谢物。同时选用峰高代替峰面积，峰高对于检测低含量的及极性相近的代谢产物更加灵敏，同时克服了受基线影响的困难[10-12,18-21]。结果检测出卷柏代谢产物441个，并鉴定出182个，大大提高了检测效率，使检测出的卷柏代谢物数量明显增加。

通过PLS-DA分析筛选出三个生长期卷柏样品间的15个共有差异性成分，其中5月的海藻糖、硬脂酸、麦芽糖、甘油、赤藓糖醇、棕榈酸、甘露醇的含量相对较高，5月为卷柏生命开始复苏的季节，体内海藻糖含量达到最高，海藻糖含量变化与卷柏复苏密切相关，亦与课题组前期研究结果一致[22]。PCA分析结果显示5月卷柏在代谢组成上和9月、1月采集的样品有明显不同，5月所含含量高的差异化合物个数最多，与代谢活跃有关，研究表明5月份左右有利于药效成分穗花杉双黄酮(药典含量测定成分)的积累[8,23]，与古籍记载中的“五、七月采”相符。9月的天冬氨酸、柠檬酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、焦谷氨酸、色氨酸含量相对较高，9月天气逐渐转凉，卷柏体内开始失水，机体调动体内氨基酸来抵抗外界胁迫维持机体生命。1月的蔗糖和丙氨酸的含量相对较高，可能与卷柏失水处于休眠状态有关。此结果表明卷柏一年中代谢产物的动态变化过程，说明卷柏一年中参与代谢过程的成分因时间的变化而变化。经过SPSS分析得出天冬氨酸、柠檬酸、谷氨酰胺、焦谷氨酸、色氨酸和棕榈酸在三个不同生长阶段样品中均表现显著差异，说明这6个化合物含量最易受到生长期的影响，并结合代谢通路分析，得出丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢受影响最大，糖分解代谢的中间产物可以转变成组成蛋白质的许多非必需氨基酸，从而参与氨基酸代谢途径，与课题组前期研究一致。推测丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸在卷柏复苏与代谢调控中发挥重要作用。研究结果为卷柏药材质量评价、采收及复苏机制研究提供科学依据。