扶正化瘀方对NK92细胞活化和杀伤功能的影响

平大冰，孙 鑫，彭 渊，胡旭东，陶艳艳，刘成海,3*

(1.上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所，上海 201203；2.上海中医药大学基础医学院生物教研室，上海 201203；3.上海市中医临床重点实验室，上海 201203)

自然杀伤细胞(natural killer cells，NK cells)是先天免疫系统重要的免疫细胞，是人体抵抗癌细胞和病毒感染的第一道防线，充当免疫反应的调节剂[1]。NK细胞具有很强的免疫调节功能，可以通过直接杀伤肝星状细胞而具有抗纤维化活性[2]。扶正化瘀方(制剂为胶囊或片剂)由丹参、桃仁、虫草菌丝、松黄、五味子、绞股蓝组成，是上海中医药大学肝病研究所研制的抗肝纤维化中药新药(Z20020073)，目前广泛应用于临床治疗肝纤维化和肝硬化，研究发现其可能通过调节机体免疫微环境发挥抗肝纤维化作用[3]，但其对NK细胞的影响尚不明确。本研究拟通过人外周血NK细胞系NK92细胞，探讨扶正化瘀方对NK细胞的活化和杀伤功能影响，为进一步研究扶正化瘀方对机体免疫微环境调节提供依据。

1 材料

1.1 细胞 人外周血NK细胞NK92(ATCC®CRL-2407TM)，悬浮生长，购自美国ATCC细胞库。NK92细胞在Tank细胞无血清培养基中培养。人慢性髓系白血病细胞K562(3131C0001000700029)，悬浮生长，在自然杀伤分析中广泛作为高敏感的体外受体，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，K562细胞在含有10%FBS的IMDM培养基中培养。所有细胞均培养在37 ℃、5%CO2环境中。

1.2 药物 聚肌胞苷酸(Poly I:C，货号P9582)，购自美国Sigma公司，批号118M4035V。扶正化瘀方浸膏粉，批号180206，由上海黄海制药有限责任公司提供，每24 g全方中丹参以丹酚酸B计不低于15.6 mg/批，以丹参素钠计不低于13.2 mg/批，虫草菌丝以腺苷计不少于4.8 mg/批，五味子以五味子乙素计不少于2.28 mg/批。

2 方法

2.1 给药 将扶正化瘀方浸膏粉溶于DMSO(美国Sigma公司，批号0231)中，制成100 mg/mL贮备液，使用时用培养基稀释至所需质量浓度。首先，以不同质量浓度(0～400 μg/mL)扶正化瘀方孵育细胞24 h以评估该方对NK92细胞的活力影响，确定最大无毒质量浓度，然后在无毒剂量范围予不同质量浓度(不少于3个)该方以观察它对NK92细胞功能的影响。Poly I:C粉末首先溶于无菌PBS中，制成10 mg/mL贮备液，给药时以培养基稀释成100 μg/mL，作为阳性对照药组[4]。

2.2 细胞活性检测 采用Cell Counting Kit-8(上海碧云天生物技术有限公司，批号40203ES60)试剂盒检测细胞活性，具体操作根据说明书进行。

2.3 Annexin V/7-AAD复染法检测细胞凋亡 NK92细胞种板后药物孵育8 h，收集细胞，Annexin V PE/7-AAD孵育染色15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡，以阴性对照管调节电压，单染管调节荧光补偿，FlowJo V10.0软件分析早期凋亡(Annexin V+7-AAD-)和晚期凋亡(Annexin V+7-AAD+)的细胞占比。

2.4 荧光定量PCR检测mRNA表达 采用总RNA抽提试剂盒(批号B511321)提取NK92细胞总RNA，逆转录试剂盒PrimescriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser(批号RR047A)将其逆转录成单链cDNA，TBGreenTMPremix EX TaqTM扩增试剂盒(批号RR420A)进行PCR扩增，以上试剂均购自日本TaKaRa公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体见表1。

表1 PCR引物Tab.1 Primers for PCR

2.5 流式细胞术检测细胞表面分子 NK92细胞种板后加药物孵育，收集细胞进行流式孵育染色。使用FITC anti-human CD314(NKG2D，Clone：1D11，批号320820)、APC anti-human CD337(NKp30，批号325210)、Alexa Fluor®700 Anti-Human CD335(NKp46，批号331932)对细胞进行表面分子观察，以上抗体均购自美国BioLegend公司，再使用Flowjo V10.0软件进行分析。

2.6 ELISA检测细胞因子分泌水平 NK92细胞种板后加药物孵育，收集细胞上清，采用Human Interferon γ ELISA Kit(人γ干扰素ELISA试剂盒，批号EK0373)、Human Granzyme B ELISA Kit(人颗粒酶B ELISA试剂盒，批号EK1114)检测上清中细胞因子水平。

2.7 NK92细胞与CFSE-K562细胞共培养杀伤体系建立 NK92细胞种板后药物孵育8 h，设空白对照组和Poly I:C阳性对照组，制备5 μmol/L CFSE工作液，与K562细胞预孵育20 min染色标记。收集孵育后NK92细胞，按照4∶1比例与K562细胞共培养4 h后7-AAD+染色，流式细胞术在CFSE(FITC)阳性信号门内观察7-AAD+染色细胞比例。

3 结果

3.1 扶正化瘀方对NK92细胞的毒性 扶正化瘀方质量浓度在0～100 μg/mL时，对NK92细胞活性无明显损伤；在200 μg/mL时，细胞存活率开始下降；在400 μg/mL时，NK92细胞活性受到明显抑制，即最大无毒剂量为100 μg/mL，见图1。

图1 扶正化瘀方对NK92细胞的毒性Fig.1 Cytotoxicity of Fuzheng Huayu Decoction on NK92 cells

3.2 扶正化瘀方对NK92细胞凋亡的影响 扶正化瘀方质量浓度在0.1～10 μg/mL时，能降低NK92细胞早期、晚期凋亡率(P<0.05)；在100 μg/mL时，仅对晚期凋亡率有抑制作用(P<0.05)，见图2。

注：与空白对照组(0 μg/mL)比较，*P<0.05，**P<0.01。图2 扶正化瘀方NK92细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of Fuzheng Huayu Decoction on the apoptosis of NK92

3.3 扶正化瘀对NK92细胞表面激活型受体mRNA表达的影响 扶正化瘀方质量浓度在100 μg/mL时，可上调NK细胞表面激活型受体NKG2D、NKp30、NKp46 mRNA表达(P<0.05)，并且在低质量浓度时对NKG2D、NKp46 mRNA表达也有一定的促进作用，见图3；在12.5～100 μg/mL时，均可不同程度增加NK92细胞表面激活型受体NKG2D、NKp30、NKp46表达，其中100 μg/mL下对NKG2D的促进作用更明显，见图4。

注：与空白对照组(0 μg/mL)比较，*P<0.05。图3 扶正化瘀方对NK92细胞NKG2D、NKp30、NKp46 mRNA表达的影响Fig.3 Effects of Fuzheng Huayu Decoction on mRNA expressions of NKG2D,NKp30 and NKp46 of NK92

3.4 扶正化瘀方对NK92细胞分泌IFN-γ和Granzyme B水平的影响 扶正化瘀方质量浓度在12.5～50 μg/mL时，可明显促进NK92细胞分泌IFN-γ因子(P<0.05，P<0.01)，并呈剂量依赖性；在0 μg/mL时，还可促进NK92细胞分泌Granzyme B(P<0.05)，见图5。

3.5 扶正化瘀方对NK92细胞杀伤K562细胞功能的影响 与CFSE-K562细胞对照组比较，NK92细胞可促进K562细胞的凋亡(P<0.01)，提示共培养杀伤体系建立成功；与共培养对照组比较，Poly I:C阳性对照组可促进NK92细胞杀伤K562细胞的能力，促进K562细胞凋亡(P<0.01)；扶正化瘀方质量浓度在25～100 μg/mL时，均可提高NK92细胞杀伤K562细胞的作用(P<0.05，P<0.01)，并呈剂量依赖性，见图6。

注：与空白对照组(0 μg/mL)比较，*P<0.05，**P<0.01。图4 扶正化瘀方对NK92细胞表面激活型受体表达的影响Fig.4 Effects of Fuzheng Huayu Decoction on activated surface receptor expression of NK92

注：与空白对照组(0 μg/mL)比较，*P<0.05，**P<0.01。图5 扶正化瘀方对NK92细胞分泌IFN-γ、Granzyme B水平的影响Fig.5 Effects of Fuzheng Huayu Decoction on the levels of IFN-γ and Granzyme B secreted by NK92

注：与CFSE-K562对照组比较，**P<0.01；与CFSE-K562+NK92对照组比较，#P<0.05，##P<0.01。图6 扶正化瘀方对NK92细胞杀伤K562细胞功能的影响Fig.6 Effect of Fuzheng Huayu Decoction on NK92 cells-induced cytotoxicity to K562

4 讨论

扶正化瘀方由丹参、桃仁、虫草菌丝、松黄、五味子和绞股蓝组成，临床试验发现其对阻止肝纤维化的发展具有良好作用趋势[5]，目前成为临床上治疗肝纤维化和肝硬化的常用药物[6]。课题组前期研究发现，扶正化瘀方发挥抗肝纤维化作用可能与其对机体免疫调节有关，其可以通过抑制MAPK信号通路抑制M1型巨噬细胞极化，发挥抗炎、抗肝纤维化作用[7]。自然杀伤(NK)细胞是机体免疫环境重要的免疫细胞，属于天然免疫系统的核心细胞，在体内负责杀伤老化细胞，发挥抗感染、抗肿瘤等重要作用，与慢性肝炎、酒精性/非酒精性脂肪性肝炎、肝细胞癌等肝脏疾病关系密切[8]。近年来，NK细胞可以杀伤活化肝星状细胞的研究也已经被证实[9-10]。

NK92细胞株是来源于人恶性非霍奇金淋巴瘤外周血的永生化NK细胞系，目前被广泛应用于研究药物对NK细胞功能的影响[11-12]。NK细胞识别自我与非我过程通过表达多种受体执行功能，其中包括C型凝集素家族如NKG2D受体[13]，天然细胞毒性受体(NCR)如NKp30、NKp44和NKp46受体[10]。本实验研究发现，在扶正化瘀方对NK92细胞的最大无毒质量浓度范围内，扶正化瘀方在低质量浓度时可以有效保护NK92细胞的自发凋亡。不同剂量扶正化瘀方作用于NK92细胞后，可以不同程度的提高其表面激活型受体NKG2D、NKp30和NKp46在转录水平的表达；流式细胞术分析结果也观察到扶正化瘀方对NKG2D、NKp44和NKp46受体有上调作用。NK细胞发挥对靶细胞的杀伤作用，除了表面激活型受体的活化外，还可以通过受体-配体结合方式，诱导NK细胞分泌大量如IFN-γ、穿孔素和颗粒酶等细胞因子，发挥杀伤作用[11]。因此，本研究也观察了扶正化瘀方对NK92细胞分泌细胞毒性分子的影响，发现扶正化瘀方可以增强NK92细胞分泌IFN-γ和颗粒酶B的能力。

由于NK92细胞不表达CD16分子，因此没有抗体依赖性介导的细胞毒效应，可以非特异性直接杀伤靶细胞[14]。于是本研究观察了扶正化瘀方对NK92细胞杀伤作用的影响，以目前比较公认的聚肌胞苷酸(Poly I:C)NK细胞激动剂作为阳性对照药[15]。实验结果显示不同质量浓度扶正化瘀方可以明显增强NK92细胞对靶细胞K562的杀伤作用，且呈现一定的质量浓度梯度依赖性。

综上所述，扶正化瘀方可以促进NK92细胞活化并增强其杀伤靶细胞功能，从而发挥调节肝脏区域免疫微环境的作用。