HPLC法测定苏格木勒-10中5种成分

良 良，陈香梅，鲍布日额，张媛媛，王秀兰

(内蒙古民族大学,内蒙古 通辽 028005)

苏格木勒-10是始载于《四部医典》的主治肾寒、尿闭、结石病的蒙药复方[1]，由益智、干姜、白硇砂、荜茇等10味药材组成，疗效显著[2-3]。方中君药益智中的圆柚酮、杨芽黄素[4]具有保护肾脏，抗肿瘤增殖和促凋亡[5]，抗炎[6]和抗应激[7]，抑制炎症、凋亡和自噬[8-10]，调节免疫等作用，可用于多种肾脏疾病的治疗；使药干姜所含6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚具有抗心肾损伤[11-12]，抗炎[13]，抑制肿瘤活性，抗氧化[14]，抗卵巢癌[15-16]作用。目前。关于苏格木勒-10质量研究的报道集中在个别单药单一成分含量测定上[17-19]，难以完整系统地体现该蒙药方剂成分的多样性。因此，本实验采用HPLC法测定方中君药益智主要成分圆柚酮、杨芽黄素，以及使药干姜主要成分6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的含量，以期为完善其质量标准提供参考。

1 材料

1.1 仪器 ULMATE3000高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Nikon E200电子显微镜、DS-U3拍照装置(北京恒三江仪器销售有限公司)；T-1700M马弗炉(郑州天纵电气设备有限公司)；DHG-9023A电热恒温箱(宁波江南仪器厂)；AUY-120电子天平(最大210 g，感量0.01 mg，日本岛津公司)；KQ-100E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；MILLIPORE型纯水机[序列号SH3CA00008A，默克密理博实验室设备(上海)有限公司]；0.22 μm微孔滤膜(天津市津腾实验设备有限公司)；RE-52旋转蒸发器(功率50 W)、B220恒温水浴锅(功率1 000 W)(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试剂与药物 6-姜酚(批号191115，纯度≥98%)、8-姜酚(批号200204，纯度≥98%)、10-姜酚(批号190513，纯度≥98%)对照品均由北京北纳创联生物技术研究院提供；诺卡酮(批号A10J10R79508，纯度≥98%)、杨芽黄素(批号Z17O8X44888，纯度≥98%)对照品均由上海源叶生物科技有限公司提供。乙腈为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

益智仁(批号20190512，产地安徽)、干姜(批号20190904，产地安徽)、榧子(批号20200807，产地安徽)、白硇砂(批号20200322，产地新疆)均购自安徽省金芙蓉中药饮片有限公司；莲子(批号20200127，产地湖南)、荜茇(批号20190521，产地广西)均购自安徽中美堂中药饮片有限公司；冬葵果(批号20170768，产地河北)、苦石莲(批号20200207，产地四川)、方海(批号20200121，产地山东)均购自安国市彤康药业有限公司；麝香(批号20140704，产地河北)购自河北省菁草堂医药贸易有限公司)，上述药材经内蒙古民族大学蒙医药学院鲍布日额教授鉴定为正品。

按《中华人民共和国卫生部药品标准》(蒙药分册1998)[18]记载，称取益智、方海各150 g，干姜、白硇砂、荜茇、榧子、冬葵果、莲子、苦石莲各60 g，麝香0.1 g，制成苏格木勒-10(S11)，其余11批(S1～S10、S12)购于10家医院制剂室，具体见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚 Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相水(含0.2%磷酸)(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～8.5 min，30%～35%A，70%～65%B；8.5～10 min，35%～30%A，65%～70%B；10～22 min，30%A，70%B)；体积流量0.8 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL；检测波长205 nm。

2.1.2 圆柚酮、杨芽黄素 Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相水(含0.2%磷酸)(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～8.0 min，30%～27%A，70%～73%B；8.0～12 min，27%～22%A，73%～78%B；12～17 min，22%～27%A，78%～73%B；17～20 min，27%～30%A，73%～70%B)；体积流量0.8 mL/min；柱温30 ℃；检测波长238 nm；进样量5 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 取圆柚酮、杨芽黄素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚对照品适量，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解定容，摇匀，得质量浓度分别为2 000、2 000、1 000、2 000、2 000 μg/mL的贮备液，再分别进一步稀释至200、200、103.13、200、200 μg/mL，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密称取全方(S11)粉末5 g，置于200 mL圆底烧瓶中，加75%甲醇100 mL，超声(功率100 W)处理30 min，滤过，滤液减压浓缩，冷却至室温，甲醇定容至5 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按全方工艺分别制备缺益智、缺干姜的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 精密量取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果图1～2。由此可知，在该色谱条件下各成分均能达到基线分离，分离度均大于1.5，理论塔板数以6-姜酚峰计均不低于8 000，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

1.杨芽黄素 2.圆柚酮1.tectochrysin 2.nootkatone图1 杨芽黄素、圆柚酮HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of tectochrysin and nootkatone

1.6-姜酚 2.8-姜酚 3.10-姜酚1.6-gingerol 2.8-gingerol 3.10-gingerol图2 6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of 6-gingerol,8-gingerol and 10-gingerol

2.3.2 线性关系考察 精密称取对照品溶液0.25、0.50、1.0、2.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀，分别精密量取5 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以各成分质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验 取供试品溶液5 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得圆柚酮、杨芽黄素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面积RSD分别为1.33%、1.47%、1.29%、2.14%、1.05%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取供试品溶液适量，室温下于0、2、4、6、8、10、24、36 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得圆柚酮、杨芽黄素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面积RSD分别为1.11%、1.86%、2.50%、2.20%、1.92%、1.21%，表明溶液在36 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取全方(S11)6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得圆柚酮、杨芽黄素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚含量RSD分别为1.73%、1.12%、2.16%、1.76%、1.47%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取各成分含量已知的全方(S11)9份，每份2.5 g，分别按1.5∶1、1∶1、0.5∶1比例加入对照品(圆柚酮793.5、529、264.5 μg/g，杨芽黄素3.57、2.38、1.19 μg/g，6-姜酚175.05、116.7、58.35 μg/g，8-姜酚23.38、15.6、7.78 μg/g，10-姜酚8.72、5.81、2.91 μg/g)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，圆柚酮、杨芽黄素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚平均加样回收率分别为99.09%、88.72%、100.74%、96.80%、95.08%，RSD分别为0.84%、1.42%、1.11%、3.03%、1.12%。

2.3.7 样品含量测定 取12批全方(S1～S12)，每份5 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定3次，计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果(μg/g，n=3)Tab.3 Results of content determination of various constituents(μg/g,n=3)

3 讨论与结论

本实验根据文献[13，19-20]对5种成分进行波长筛选，发现6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚在205 nm处均有吸收峰，并且6-姜酚、8-姜酚有较大吸收，而圆柚酮、杨芽黄素在238 nm处吸收较好。因此，在保证各成分检测灵敏度及基线分离的情况下，选择205、238 nm作为检测波长。然后，考察了乙腈/甲醇与水/水(含磷酸)的组合，发现乙腈-水(含磷酸)的洗脱能力更优，并且磷酸体积分数为0.2%时无拖尾，故选择其作为流动相。再考察了75%甲醇、95%乙醇的提取效果，发现其中前者提取时峰面积、基线稳定性、噪声、分离度优于后者，而且超声提取相较于回流提取，具有峰面积大、基线平稳、噪声小、分离度理想、杂峰少、操作简便的优点。

含量测定结果显示，12批苏格木勒-10中圆柚酮、6-姜酚含量均较高，杨芽黄素、10-姜烯酚含量相当，8-姜酚含量均较低；S4中8-姜酚含量明显低于其他批次；S11中圆柚酮、10-姜酚含量最高；S7中杨芽黄素含量最高；S2中6-姜酚含量最高；S3中8-姜酚含量最高。虽然上述成分含量差异较大，但因它们为方中君药益智、使药干姜的主要活性成分[17,19-21]，故仍将其作为检测指标。

综上所述，本实验首次建立HPLC法测定苏格木勒-10中圆柚酮、杨芽黄素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的含量，该方法简便准确、专属性、重复性良好，检测成本低，可为完善和提高该方质量标准提供依据。