外源EBR对NaCl胁迫下颠茄幼苗光合色素含量及荧光特性的调节

辛正琦， 何会流

(1.西南大学 a.生命科学学院 b.三峡库区生态环境教育部重点实验室， 重庆 400715； 2.重庆城市管理职业学院， 重庆 401331)

0 引言

颠茄(AtropabelladonnaL.)是茄科颠茄属多年生草本植物，整株均可入药，药材气微辛，味微苦.在临床上，颠茄的次生代谢物被广泛作为一种抗胆碱类药物，靶向作用于副交感神经系统，在市场上缺口较大，商业价值高[1].在中国，颠茄主要种植在山东、上海和浙江等国内沿海大中城市和地区，而上述区域由于地理因素影响土地盐渍化程度广泛，对颠茄的生长发育带来了很大的危害.

盐胁迫下植物生长发育会被抑制，一般认为是由于盐胁迫导致了光合作用效率的降低而造成的.盐胁迫能够破坏PEP羧化酶和RuBP羧化酶的活性，从而造成叶片中叶绿体结构受损，不利光合色素的合成与积累，进而影响光合作用的进行[2].植物将自然界的光能转化为自身的化学能，主要是利用光系统Ⅰ(PSⅠ)和光系统Ⅱ(PSⅡ)发挥的作用，其中光系统Ⅱ表现出对NaCl胁迫更加敏感，故常作为研究人员研究植物响应盐胁迫的重点[3].李阳等[4]发现NaCl胁迫处理后，棉花叶片净光合速率、气孔导度、qP、Fv/Fm等均显著下降，表明盐胁迫会导致PSⅡ受损，从而影响植物的光合作用.

油菜素内酯(brassionolide，BR)作为一种新型植物生长调节剂，在植物生长发育以及对逆境胁迫响应等方面具有重要作用，因此在农林业生产中被广泛使用[5].2,4-表油菜素内脂(EBR)是常见的人工合成高活性油菜素内酯类似物.科学研究已经表明，BR可以稳定保持植物植株内的叶绿素浓度处于较高水平，从而有效提高植物叶片的光合速率[6]，且EBR对盐胁迫下刺槐和香樟[7]、垂丝海棠[8]等植物的光合能力具有积极的调节作用.但是目前关于外源EBR是否能调节盐胁迫下颠茄的光合能力尚未有报道.本实验以颠茄为实验对象，在室内模拟NaCl胁迫环境，设置4种不同浓度的外源EBR，研究在NaCl胁迫下外源EBR对颠茄的叶绿素含量及荧光特性的影响，探讨EBR在盐胁迫下对颠茄幼苗光化学反应的调节作用，为拓展对EBR生物学功能的认知以及农林栽培中改善盐害问题提供一定的理论基础.

1 材料与方法

1.1 材料及处理

试验于西南大学生命科学学院进行，颠茄(AtropabelladonnaL.)种子购自湖南省永州市.筛选饱满、健康的种子，用0.05 mol·L-1赤霉素浸泡2 d，再均匀洒在湿润的滤纸上，使其萌发.种子萌发约2周后，移栽到装有土、珍珠岩、蛭石(比例为3∶1∶1)的盆钵中生长，每个处理组6钵，每钵2、3株幼苗.待颠茄幼苗株高达到10 cm左右时进行盐胁迫试验.

取一定量NaCl固体，溶于稀释十倍的MS营养液中，配置为100 mmol·L-1NaCl溶液，每7 d浇灌一次土壤以模拟盐胁迫环境条件.不同浓度的EBR处理采用对颠茄叶面喷施的方式，每日固定时间喷洒.本实验中，设置6个处理组：CK(0 mmol·L-1NaCl+H2O)、T0(100 mmol·L-1NaCl+H2O)、B1(100 mmol·L-1NaCl+0.05 mg·L-1EBR)、B2(100 mmol·L-1NaCl+0.1 mg·L-1EBR)、B3(100 mmol·L-1NaCl+0.2 mg·L-1EBR)、B4(100 mmol·L-1NaCl+0.4 mg·L-1EBR).每个处理组设置3个重复，处理第5 d，10 d，15 d时，进行下列指标的测定.

1.2 相关指标的测定

1.2.1 叶片光合色素的测定

参考张宪政[9]的试验方法，步骤略微有改动:用电子天平准确称取0.2 g颠茄叶片，置于试管中，加入10 mL的无水乙醇、丙酮混合液(比例为1∶1)，密封避光保存48 h后，至所有颠茄叶片完全呈现白色，可用于后续的测定.取3 ml上清液，用紫外分光光度计测定其663、645、470 nm处的吸光值，再利用公式可得出颠茄叶片中叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素的含量.

1.2.2 叶绿素荧光动力学参数的测定

叶绿素荧光参数通过PAM-2100便携式叶绿素荧光仪检测.测定之前，颠茄植株须预先进行2～3 h的黑暗处理.测定于较暗的环境中进行，选择暗适应完全，颠茄完整、平展的叶片，放在仪器上进行最小荧光(F0)、非光化学荧光猝灭系数(NPQ)、光化学荧光猝灭系数(qP)、光系统Ⅱ实际量子产量(Yield)、最大量子产量(Fv/Fm)的测定，每个处理组进行3次重复平行试验，用3次试验结果的平均值进行最终的数据分析.

1.3 数据处理

使用Excel和SPSS对数据进行整理和统计分析，采用单因素方差分析和Duncon多重比较及差异显著性分析，所有数据均以“平均值±标准误差”表示.

2 结果与分析

2.1 外源EBR对盐胁迫下颠茄叶片光合色素含量的影响

植物叶片中光合色素含量是体现植物光合能力的一项主要指标，环境因子的变化也会导致光合色素含量的改变，从而影响植物光合作用的进行[10].盐胁迫处理后，各个处理时间段内，颠茄叶中光合色素含量变化如表1所示，均明显降低，在15 d时，T0组叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量分别较对照组下降了38.483%，31.807%，36.259%，37.471%.表明盐胁迫抑制了颠茄叶片光合色素的合成.

为研究盐胁迫条件下，外源EBR对颠茄叶光合色素水平的调节作用，通过应用不同浓度的EBR进行实验，结果表明，与T0组相比，外源EBR的参与使叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量及类胡萝卜素的含量都保持在较高的水平上，且在相同处理天数时，随着EBR浓度的提高，处理效果呈现先升后降的趋势.处理到10 d时，B3组中颠茄叶片的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量及类胡萝卜素的含量相较于胁迫组(T0)分别升高了28.841%、30.753%、29.322%、45.635%.第15 d时，当EBR浓度为0.1 mg·L-1时，即B2组中颠茄叶片中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素含量相较于T0组分别升高了32.785%、42.049%、35.779%、22.794%，总体效果最好，但光合色素含量仍显著低于对照组.说明适宜浓度的外源EBR可以减少盐胁迫对颠茄光合性能的损害，提高光合色素含量.

表1 不同处理方式对NaCl胁迫下颠茄叶光合色素含量的影响

2.2 外源EBR对盐胁迫下颠茄叶片叶绿素荧光参数的影响

2.2.1 对暗适应荧光参数的影响

叶绿素荧光参数可以直接在生长中的植物叶片上检测，而不影响植物的正常生长，并且可以在短时间内得到大量信息，用以分析植株的光合结构及其功能.因此，叶绿素荧光参数是理想的光合作用探针，被广泛应用于植物抗逆抗病研究[11].初始荧光参数F0表示光系统Ⅱ反应中心处于完全开放时的荧光产量.植物叶片中的叶绿体类囊体薄膜遭到损伤时，F0的值会增大(见图1).

图1 不同浓度EBR处理对NaCl胁迫下颠茄叶片暗适应荧光参数的影响

如图1(a)所示，在各个处理阶段内，相较于CK组，T0组中盐胁迫处理均导致F0值大幅增加.表明颠茄光系统Ⅱ反应中心遭受盐胁迫的破坏，光合作用因而遭到抑制.结果还表明：在各个处理时间内，外源EBR的加入缓解了F0的升高.处理第5 d时，随着EBR浓度的升高，F0逐渐降低.处理后期(10～15 d时)，B2—B4组F0值相较于T0组均显著降低.表明长期盐胁迫处理时，较高浓度的EBR能够显著降低F0，有效缓解盐胁迫造成的PSⅡ反应中心损伤和光抑制.

Fv/Fm表示暗适应样品中光系统Ⅱ的最大量子产量，Fv/Fm在植物叶片受到明显光抑制时会显著降低，是一个反映植物光系统损伤程度的常用指标[12].如图1(b)所示，盐胁迫处理后，随着时间的增加，Fv/Fm逐步降低.处理第5、10和15 d时，T0组Fv/Fm相较于对照组分别下降了7.602%、13.254%和16.510%.而不同浓度外源EBR的应用，均提高了盐胁迫下Fv/Fm值.其中，B2和B3处理组的作用效果较好，且二者几乎不存在显著性差异.以上结果表明，NaCl胁迫能够引起Fv/Fm显著降低，颠茄叶片光系统Ⅱ反应中心的量子产量逐渐下降，颠茄叶片光合能力可能受到了抑制.而喷施0.1 mg·L-1和0.2 mg·L-1外源EBR，则可以有效缓解这一现象，从而提高颠茄的光合效率.

2.2.2 对光适应荧光参数的影响

光化学荧光猝灭系数qP，代表的是光系统Ⅱ中的色素所吸收的光能被用于光化学反应电子传递的效率，qP值越大，表明光系统Ⅱ中的电子传递活跃度就越高[13].非光化学荧光猝灭系数NPQ，表示在绿色植物进行光合作用时，由热耗散所产生的荧光猝灭，反映了植物把过剩的光能转化为热能的能力[14](见图2).

图2 不同浓度EBR处理对NaCl胁迫下 颠茄光适应荧光参数的影响

从图2(a)中可知，NaCl胁迫条件下，qP显著降低，且随着处理天数的增多，降低幅度也越来越大.说明当植物遭受盐胁迫时，qP值会显著降低，且随着胁迫持续时间的增长影响也越来越大.不同浓度EBR应用后，在各处理组中qP值均有增加.如图2(b)所显示，在盐胁迫条件下，T0组NPQ较CK组明显升高，且在整个处理期内持续升高.15 d时，T0组中NPQ达到最高，比CK组明显提高了16.724%.经不同浓度EBR处理后，NPQ值显著减小.除第5 d以外，NPQ随外源EBR浓度增加呈现先降后升的现象.到15 d时，当EBR浓度为0.1mg·L-1时NPQ值最小，与对照组并无显著性区别，相较于T0组降低了12.715%.表明在盐胁迫期间，叶片光能热耗散量加大，叶片可能利用非光化学猝灭提高热耗散能力来消耗过多的激发能以适应盐胁迫环境条件.0.1 mg·L-1EBR能够显著消除盐胁迫下NPQ的升高，降低了盐胁迫对光合机构造成的危害.

Yield代表的是植物叶片中光系统Ⅱ的实际量子产量，也反映了光系统Ⅱ在部分反应中心关闭的情况下，植物叶片实际的光能捕获效率[15].如图2(c)所显示的，在不同时期内，CK组Yield数值的高低变动不大，在盐胁迫条件下，T0组Yield远远低于CK组.外加不同浓度EBR处理后，Yield均有不同程度的提高.总体来说，在各处理时段内，B2和B3处理效果更为理想.以上结果表明，盐胁迫导致了颠茄叶片的原初光能捕获效率大大降低，EBR的加入可以有效减弱这一现象，在EBR浓度为0.1 mg·L-1和0.2 mg·L-1时效果最好.总之，EBR的加入能够有效增加植物吸收的光能中用于光化学的比例，加快盐胁迫下颠茄叶片PSⅡ中的电子传递速率，从而提高了植物对盐胁迫的适应能力.

3 讨论

植物在生长发育的过程中，会遭受到不同的环境胁迫，例如盐碱胁迫、过度紫外线辐射、低温、高温、干旱、重金属和机械损伤等等，从而产生了一系列复杂的防护机制，来识别和适应自身所处的自然环境[16-17].所以，认识植物生长发育中的各种生理过程和防护机制对植物科学发展有着重大的意义[17].盐是植物生长过程中常常遇到的非生物胁迫因子，也是影响植物生长发育和生理代谢的一种非常重要的因素[18-19].

光合作用作为绿色植物机体内主要的新陈代谢过程，能够影响植物生根发芽、开花结果、产出及对周围环境的适应性.光合色素作为植物光合作用的载体，其含量的多少体现出植物进行光合作用效率的高低，直接影响光合速率和光合产物的积累[20].环境因子的改变也会引起光合色素含量改变.本研究中，盐胁迫导致颠茄幼苗叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素降解加速或合成遭到抑制，特别是叶绿素b对胁迫反应更为敏感.光合色素含量显著降低，从而影响了光合作用的正常进行.这和盐胁迫下半夏[21]、玉米[22]和沙枣苗木[23]的研究基本一致.光合色素主要存在叶绿体的基粒中，层层堆叠的基粒片层是类囊体的重要组成部分，在本试验中，EBR能够有效促进颠茄叶片光合色素含量增加，表明外源EBR有助于缓解盐胁迫对叶绿体膜系统的伤害，提高光合色素的合成效率，减少光合色素的分解，减缓叶绿体老化、基粒片层数目减少，保证叶绿体结构和功能的稳定性，有效提高了颠茄的光合效率及其耐盐性.这和EBR处理紫花苜蓿[24]、樟树[25]后的结果一致.

叶绿素荧光参数是植物体内叶绿素含量变化的重要指标，它和植物光合中的各项化学反应变化有关联，涉及多种光合作用信息，非常容易受到植物逆境胁迫的影响.由于叶绿素的含量也影响着PSⅡ的光能利用效率[26]，所以盐胁迫在影响植物叶绿素含量的同时，也对其叶绿素荧光参数产生了相应的影响.盐胁迫条件下，植物叶绿体光合机构会遭到损伤，PSⅡ光能利用率减小且PSⅡ的潜在活性被抑制[27].本研究发现，盐胁迫使得颠茄叶片Fv/Fm降低，意味着发生了光抑制.F0升高、qP、Yield降低，表明叶绿体类囊体薄膜和PSⅡ反应中心发生了损害，电子传递功能被严重抑制.应用一定浓度的外源EBR后，Fv/Fm、Yield和qP明显增加，F0降低，说明外源EBR可以减弱盐胁迫条件下颠茄幼苗叶片光合机构和PSⅡ反应中心受到的影响，从而提高叶片中电子传递速率，改善光合作用效果.同时，盐胁迫导致NPQ显著升高，这是由于逆境胁迫使得PSⅡ反应中心受损，光合效率降低，进而导致光合色素吸收的光能用于光化学反应的份额减少，更多的光能被热耗散掉，这种耗散机制可能是颠茄对盐胁迫的一种防御响应.另外周丹丹[28]通过研究盐胁迫对朴树和速生白榆的叶绿素荧光特性的影响得出了相似的结论.而EBR处理后NPQ显著降低，表明外源EBR能够有效减少逆境胁迫下颠茄叶片中光能的热耗散，有利于光合作用的正常进行.这与王舒甜等[29]在香樟叶片中的研究结论基本一致.

4 结论

综上所述，NaCl胁迫使颠茄叶片中光合机构受到破坏，光合色素含量明显减少，同时叶绿素荧光参数F0、NPQ明显增加，而Fv/Fm、qP、Yield则明显下降.0.1 mg·L-1EBR处理，可以有效提高颠茄叶片光合色素的产生和积累，减少盐胁迫条件对PSⅡ反应中心造成的损伤，从而提高植物的光合能力，增加植物的耐盐性，进而减少盐胁迫对颠茄生长发育的抑制.在实际生产过程中，也可以考虑外施适宜浓度的EBR，来处理颠茄栽培过程中可能出现的盐害问题，从而增加其抗逆能力，保护植物正常生长.但是，关于外源EBR对颠茄幼苗盐胁迫的内部反应机制的作用还需进一步研究.