外泌体源性的微小RNA在肝癌中的研究进展

赵琛 张尤历 徐岷

肝癌是常见的恶性消化道肿瘤，包括肝细胞癌(HCC)、肝内胆管上皮细胞癌、肝母细胞瘤及纤维板层癌。其中，HCC占肝癌的90%以上，具有早期不易发现、进展快等特点。尽管目前在肝癌预防、筛查、诊断和治疗技术方面取得了一定进展，使我国肝癌发病率和死亡率下降[1]，但肝癌仍是全球第6位、我国第3位常见的癌症[2]，严重威胁我国人民的生命和健康。血清甲胎蛋白(AFP)是目前临床上常见的诊断肝癌的标记物之一，但特异性却不高。因此，寻找更加灵敏且特异的生物标志物用于肝癌的早期诊断，对于提高肝癌患者的生存率尤为重要。

外泌体是由各种体液分泌的直径为40～100 nm级别的膜性囊泡[3]，富含蛋白质、RNA及核酸等物质。其中来源于恶性肿瘤的外泌体(TDEs)更被认为直接参与了肿瘤的增殖、转移、耐药及免疫逃逸[4]。研究发现在某些特定疾病的患者循环中微小RNA(miRNA)的表达可发生特征性的变化，外泌体包裹下的miRNA拥有更好的生物稳定性，从而使研究外泌体源性的miRNA较循环中的miRNA有着更好的前景。肿瘤细胞较正常细胞可分泌更多的外泌体，使得外泌体有可能成为早期诊断肝癌或肝癌转移的标志物，因此,充分了解外泌体促进肝癌进展的机制，对肝癌的早期诊断和预后具有重要意义。

一、外泌体和miRNA

1.外泌体结构和功能:外泌体作为一类细胞外囊泡(EVs)，最早是由Harding和Johnstone等提出。外泌体多指在正常或病理状态下，由各种细胞分泌的直径约40～100 nm的膜性囊泡，其中含有大量的生物活性成分，如蛋白质、脂质、信使RNA(mRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)和miRNA。许多细胞都可以分泌外泌体，如B淋巴细胞、T淋巴细胞、树突状细胞、肿瘤细胞、间充质干细胞等[5]。外泌体具有脂质双分子层的结构特征，能够有效保护其内容物的活性，方便其在细胞间穿梭以促进细胞间的通讯。外泌体可以与特定的受体结合，通过释放囊泡内容物的方式进行信息传递，在细胞与其微环境之间的细胞间通信中起关键作用[6]。正是通过这种方式，外泌体可参与包括细胞通讯、肿瘤增殖迁移、血管生成在内的多种生理和病理过程。

2.miRNA:miRNA是一类长度约为19～25个核苷酸的内源性非编码小RNA。miRNA可通过直接诱导mRNA降解，也可通过与靶基因mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)中的互补碱基结合来抑制翻译，从而反向调节基因表达[7-8]。miRNA可通过上述机制调节肿瘤细胞的分化、增殖和迁移。miRNA已被证实在多种肿瘤中的表达高于正常组织。与正常细胞相比，肿瘤细胞除了分泌更多的外泌体外，其分泌的外泌体中miRNA含量也比正常细胞分泌的多。Kogure等[9]提取了肝癌细胞株Hep3B衍生的外泌体，共检测出134种不同类型miRNA，其中55种miRNA表达量较其供体细胞上升4倍，25种miRNA含量上升166倍，最重要的是有11种miRNA仅在外泌体中表达。

二、外泌体源性的miRNA在肝癌发生、发展中的作用

细胞间的通讯在肝癌的发生中起重要作用。除了已有的自分泌和旁分泌等通讯方式外，外泌体为细胞信号之间的通信提供了一种独特方式。在大多数的外泌体中，特异性miRNA与肝癌的发生发展有关[10]。相关研究结果证实，与正常肝组织比较，miR-21、miR-96和miR-151在肝癌组织中的表达水平增加[11]。相比之下，miR-122a和miR-199a的表达水平在肝癌组织中则降低[12]。

1.外泌体源性的miRNA通过影响微环境促进肝癌的增殖、迁移:1889年Paget在癌症的背景下提出了“种子-土壤”假说来说明肿瘤微环境的重要性[13]。TDEs在肿瘤与其微环境中的作用尤为突出。进一步的研究发现，外泌体可通过免疫逃逸、代谢重组等方式创造一个有利于恶性肿瘤发展的前微环境。肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)是一种特殊类型的成纤维细胞，是肿瘤微环境的重要组成部分[14]，通过多种机制促进肿瘤细胞的生长和侵袭。Zhou等[15]提取了3种不同的肝癌细胞株(97H、LM3及LO2)的外泌体，对后者进行miRNA测序，发现其miR-21、miR-27、miR-126水平均显著增高，miR-21的表达水平升高最为显著。将提取后的外泌体与肝星状细胞株(LX-2)共培养后，发现LX-2激活成高表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的肿瘤相关成纤维细胞。进一步实验研究发现，miR-21可通过下调其靶基因PTEN，激活PDK1/Akt通路，促进LX-2向CAFs转化，进而促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。此外Fang等[16]研究证明肝癌细胞衍生的外泌体中miR-1247-3p通过下调靶基因B4GALT3激活核因子(NF)-κB信号通路，活化CAFs促进肝癌的肺转移。以上研究结果均表明外泌体源性的特异miRNA可以通过影响靶基因，促进CAFs的活化，进而促进肝癌的发生发展。

2.外泌体源性的miRNA促进肝癌的免疫逃逸:肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)也是肿瘤微环境中的一类重要细胞，主要分为TAMs-M1型和TAMs-M2型，其中M2型可促进肿瘤进展。肝癌衍生的外泌体可通过激活NF-κB信号通路和诱导促炎症因子来重建巨噬细胞，导致TAMs-M2活化，使肝癌逃避免疫应答[17]。Yin等[18]研究发现肝癌细胞分泌的外泌体可将miR-146a-5p转运至巨噬细胞，通过改变细胞因子来减弱巨噬细胞的抗原呈递作用，并促进巨噬细胞向TAMs-M2型转化，造成T细胞死亡。进一步研究发现，SAL4-STAT 3可协同调控miR-146a-5p的表达，过表达的miR-146a-5p可通过促进TAMs-M2型的激活进而促进肝癌的免疫逃逸。

3.外泌体miRNA和肝癌化疗耐药:HCC患者对5-氟尿嘧啶(5-Fu)和阿霉素等常规化疗药物易产生耐药性。在肝癌衍生的外泌体中，miR-122的表达量显著低于正常肝脏组织中的外泌体，miR-122可通过下调多药耐药基因(MDR1)、谷胱甘肽S转移酶π等[19]相关耐药基因来增强肝癌细胞的化疗敏感性。Fu等[20]对耐药细胞株(bel/5-Fu)进行实时定量PCR分析，结果发现miR-32-5p、miR-21-5p、miR-19a-3p、miR-92a-3p和miR-486-5p在bel/5-Fu均呈高表达，其中miR-32-5p的表达最明显。进一步研究发现，bel/5-Fu通过外泌体将miR-32-5p转运到敏感细胞，并激活PI3k/Akt通路，通过调节血管生成和EMT诱导肝癌的多重耐药。Raji等[21]的研究结果表明，miR-106a/b在顺铂耐药的肝癌中高表达，miR-106a/b通过靶向调节SIRT1的表达影响Hela细胞对顺铂的化学敏感性。

三、外泌体源性的miRNA在肝癌中的应用

外泌体中富含脂质，对外泌体的结构和内容物起保护作用，使内在的miRNA表达稳定。此外，外泌体miRNA的表达水平在一定程度上可反映出细胞的状态，使外泌体中的miRNA具有作为潜在的早期诊断标志物、评估预后及治疗的价值。

1.外泌体miRNA可作为肝癌诊断的血清标记物:Jun等[22]对正常人、慢性乙型肝炎和肝癌患者血清外泌体miR-21和总循环miR-21的表达水平进行比较分析后发现，肝癌组患者血清外泌体中miR-21水平明显高于慢性乙型肝炎组(2.12倍)和健康组(5.57倍)。此外，肝癌患者中总循环miR-21表达量虽也升高，但不如血清外泌体中miR-21表达升高明显；且外泌体中miR-21表达水平升高，与慢性肝硬化和肝癌的TNM分期呈正相关[23]，这一观察结果表明，血清外泌体中某些miRNA，如miR-21可作为一种潜在的生物标记物，用于肝癌的早期检测和筛选。

2.外泌体miRNA与肝癌的治疗:外泌体作为运输载体可运送特异性的小RNA分子，通过控制肿瘤生长实现治疗作用，开始受到广泛关注。外泌体作为运输载体较传统的运输载体具有独特优势：外泌体的双层膜结构和特异的表面蛋白可轻松进入靶细胞中，作为一种高效的载体发挥作用；外泌体还可由自身细胞分泌，不易引起免疫反应。间充质干细胞具有分泌大量外泌体的功能，Lou等[24]用脂肪源性间充质干细胞(AMSC)转染miR-122，收集AMSC衍生的外泌体加入受体肝癌细胞中，结果显示，miR-122转染的AMSC能有效产生富含miR-122的外泌体，通过改变肝癌细胞中miR-122靶基因的表达使癌细胞对化疗药物敏感。此外，在动物模型体内注射miR-122外泌体可显著提高索拉非尼的抗肿瘤效果。上述研究结果均表明外泌体作为一种独特的载体，在肝癌的发生发展中起重要作用，为临床上肝癌的诊断与治疗提供了一种新的思路。

3.外泌体miRNA与肝癌的预后评估:Shi等[25]收集了126例HCC患者及21例健康受试者的血清，从中提取外泌体并检测miR-638表达情况，发现HCC组受试者外泌体miR-638水平显著降低，降低程度与肝癌大小和TNM分期呈负相关。进一步分析表明，血清miR-638水平降低的肝癌患者3年和5年生存率较低。另有研究结果指出，血清外泌体中miR-718可通过调节HOXB8的表达抑制肿瘤细胞分化。此外，在肝癌患者肝移植治疗后，复发与未复发的肝癌患者血清外泌体中miRNA-718表达水平也存在差异，肝癌复发的患者血清外泌体中miRNA-718呈低表达，未复发的患者血清外泌体中miRNA-718呈高表达，进一步说明miRNA-718的低表达与肝癌预后不良密切相关[26]。以上研究结果均表明，血清外泌体中miRNA在肝癌中可作为新的标记物用于评估预后情况。

外泌体作为一种新的细胞间的传递介质，参与了多种生理病理过程。本文综述外泌体在肝癌发生发展中的作用，并对其在肝癌的临床应用前景进行展望。然而，目前外泌体在肝癌发生发展中的具体作用机制尚未明确，阻碍了其在肝癌诊断和治疗中的应用。此外，尽管外泌体作为临床诊断肝癌的标记物具有前景，但由于现阶段血清外泌体提取、纯化、鉴定等步骤的繁琐及困难，距离应用于临床还需要一段时间，未来的研究应集中在改进提取、纯化外泌体的方法，争取实现其在临床中的早期应用。