基于网络药理学探讨黄芪-熟地黄药对治疗骨质疏松症的作用机制Δ

冯天笑，黄湘龙，霍路遥，王 平#

(1.天津中医药大学第一附属医院骨伤科，天津 300381； 2.国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300381； 3.天津中医药大学研究生院，天津 301617)

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量减少、骨微观结构破坏和骨的脆性增加为病理特征的全身性骨骼疾病[1]。随着人口老龄化的进展，我国OP及骨质疏松性骨折(osteoportic fracture，OPF)的发病率逐年升高，致死率和致残率逐渐升高，严重影响老年患者的生活质量[2-3]。预计至21世纪中叶，我国OP患者或低骨量人群数量将达到2.12亿，给个人、家庭和社会带来沉重的负担[4]。OP发病机制复杂，成骨细胞骨形成与破骨细胞骨吸收相耦联的骨代谢平衡紊乱是疾病形成和进展的关键病理成因[5]。网络药理学通过构建药物生物作用网络，选取特定的靶点基因进行富集分析，探讨药物与疾病的相关性，预测中药治疗疾病的作用机制，指导新药研究与开发。本研究基于网络药理学的原理和方法，分析黄芪-熟地黄药对的主要成分、作用靶点及OP相关靶标，并进一步对筛选的靶标进行基因本体(gene ontology, GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，以探讨黄芪-熟地黄药对抗OP作用机制，为进一步阐释其治疗OP的物质基础和作用机制提供理论依据，为后续其活性成分开发及新药发掘提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 数据库与软件

本研究所使用的数据库及相关软件见表1，相关数据库及软件的使用时间截止至2020年8月；本研究的思路流程图见图1。

表1 本研究所使用的数据库及相关软件

图1 黄芪-熟地黄药对治疗OP的网络药理学研究流程图

1.2 黄芪-熟地黄药对活性成分及作用靶点的获取

本研究借助TCMSP平台，以“黄芪”和“熟地黄”为检索词，检索黄芪-熟地黄药对富含的活性成分。基于TCMSP平台中ADME参数，主要设定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%及类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为筛选条件对药对富含的活性成分进行筛选。化合物的OB及DL值越高，表明化合物的活性和临床应用价值越高。经过筛选后，获得药对富含的活性成分及其对应的作用靶点信息。将所获取的作用靶点逐一输入Uniport数据库，设定物种为“Homo sapiens”，对作用靶点名称进行标准化处理。由于某些作用靶点在Uniport数据库中无法检索到标准名称，故删除该类作用靶点，实际获取的作用靶点较前有所减少。

1.3 中药-活性成分-作用靶点网络的构建及网络拓扑学分析

将所获取的活性成分及潜在作用靶点信息导入Cytoscape 3.7.0软件进行可视化处理，构建中药-活性成分-作用靶点网络。然后通过软件中的“Network Analyzer”插件对所构建的作用网络进行网络拓扑学分析，以节点度值(Degree)及介度中心性(betweenness centrality)来反应节点的重要程度，明确网络中较为重要的活性成分及作用靶点。

1.4 OP相关靶标获取

以“Osteoporosis”为关键词，分别检索GeneCards、OMIM和DisGeNET数据库，收集疾病相关靶标，删除多余重复靶标后获得OP相关靶标。

1.5 中药-疾病靶点共有靶点构建

利用R语言3.6.3软件，将中药作用靶点与疾病相关靶标取交集，构建中药-疾病共同靶点的韦恩图，从而得到中药-疾病交集的靶点基因信息。

1.6 中药-疾病共有靶点蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein Interaction，PPI)网络的构建与核心靶点筛选

将中药-疾病交集靶点基因信息导入STRING 11.0数据库，设定物种为“Homo sapiens”，设置“High confidence(0.700)”及“Hide disconnected nodes in the network”，其余保留为系统默认参数，以此构建PPI网络。然后将所得信息导入Cytoscape 3.7.0软件进行分析，以节点度值大于平均节点度值为标准筛选核心靶点，并绘制条形图。

1.7 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

借助Funrich 3.1.3软件中的Gene enrichment功能对核心靶点的不同生物学过程进行分析，分别选取生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和细胞成分(cellular component，CC)模块，获取GO功能富集分析结果(P<0.05)。利用David 6.8数据库对核心靶点进行KEGG通路富集分析，获得显著富集的信号通路(P<0.05)，利用R语言3.6.3软件绘制柱状图和气泡图。

2 结果

2.1 黄芪-熟地黄药对活性成分及作用靶点的获取结果

经过检索可知，黄芪-熟地黄药对在TCMSP中共有化合物163个，其中黄芪87个，熟地黄76个。按照OB及DL参数筛选后，共获得药对富含的活性成分19个，其中黄芪17个，熟地黄2个。经过Uniport数据库对其对应的作用靶点信息进行标准化处理后，共获得作用靶点117个。

2.2 中药-活性成分-作用靶点网络的构建及分析结果

借助Cytoscape 3.7.0软件构建起中药-活性成分-作用靶点网络图，结果见图2。由图2可知，该网络共包含136个节点，1 387条边。其中右侧菱形节点代表中药，中间三角形节点代表活性成分，左侧箭头形状节点代表作用靶点，每条边代表节点与节点之间相互作用的关系。网络拓扑学分析结果显示，该网络的平均节点度值为20.323，平均介度中心性为0.008。其中，槲皮素(MOL000098)、山柰酚(MOL000422)、豆甾醇(MOL000449)、谷甾醇(MOL000359)和7-O-甲基异丙醇胺(MLO000378)等活性成分，以及IL-6、TNF、TP53、VEGFA、NOS3、MAPK1、ESR1、JUN、PTGS2和EGF等作用靶点在网络中具有重要作用，可能为黄芪-熟地黄药对发挥治疗作用的核心活性成分及作用靶点。

图2 中药-活性成分-作用靶点网络

2.3 疾病相关靶点获取及中药-疾病共有作用靶点的构建结果

经筛选去重后共获得OP相关靶点3 630个。将中药与疾病靶点相互映射共获得83个共有靶点，绘制韦恩图，见图3。图3中，左侧较大圆形代表疾病靶点，右侧较小圆形代表中药靶点，交集部分代表两者共有作用靶点。

图3 中药-疾病共有作用靶点韦恩图

2.4 中药-疾病交集靶点PPI网络的构建与核心靶点筛选结果

将83个共有作用靶点信息上传至STRING数据库，经处理后构建交集靶点PPI网络及相互作用信息，结果见图4。由图4可知，该网络共包括83个节点，356条边，各节点表示各作用靶点，每条边表示靶点蛋白间相互作用的关系。经网络拓扑学分析可知，该网络的平均节点度值为9.247，选择节点度值大于平均节点度值的25个节点为治疗的核心靶点，结果见图5。由图5可知，IL-6、JUN、VEGFA、TNF、TP53、MAPK1、MAPK8、IL-1β、EGF和PTGS2等靶点度值显著高于其他靶点，在网络中发挥着重要的联系作用，可能为黄芪-熟地黄药对发挥其治疗作用的核心靶点。

图4 中药-疾病共有靶点PPI网络

图5 核心靶点相关信息

2.5 GO功能富集分析结果

在核心靶点的GO功能富集分析中，共获取了70个GO条目(P<0.05)，其中BP、MF和CC各有10、14和46个条目，分别选取富集显著的前5条进行可视化。BP主要包括类固醇受体信号通路(steroid hormone receptor signaling pathway)、免疫反应(immune response)、信号转导(signal transduction)、转录(transcription)和细胞通讯(cell communication)，结果见图6(A)。MF主要包括细胞因子活性(cytokine activity)、配体依赖性核受体活性(ligand-dependent nuclear receptor activity)、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)、金属肽酶活性(metallopeptidase activity)和生长因子活性(growth factor activity)，结果见图6(B)。CC主要包括细胞外空间(extracellular space)、核质(nucleoplasm)、细胞外(extracellular)、细胞外区域(extracelluar region)和血小板α颗粒管腔(platelet alpha granule lumen)，结果见图6(C)。

A.BP富集分析；B.MF富集分析；C.CC富集分析

2.6 KEGG通路富集分析结果

黄芪-熟地黄药对治疗OP的核心靶点KEGG通路富集分析共获得124个条目(P<0.05)。按照P值基因富集数量综合过滤，对其进行排序，取排序居前20位的条目绘制柱状图及气泡图，结果见图7—8。由图7—8可知，黄芪-熟地黄治疗OP核心靶点的KEGG通路主要涉及糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路(fluid shear stress and atherosclerosis)、人巨细胞病毒感染信号通路(human cytomegalovirus infection)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPK signaling pathway)、内分泌失调信号通路(estrogen signaling pathway)、南美锥虫病(Chagas disease/American trypanosomiasis)、C型凝集素受体信号通路(C-type lectin receptor signaling pathway)和TNF信号通路(TNF signaling pathway)等。

图7 KEGG 通路富集分析柱状图

3 讨论

中药具有多组分的特征，作用于人体的机制相对复杂。基于动物实验或细胞实验等方法的传统中药研究策略难以充分阐明黄芪-熟地黄药对抗OP的作用机制。因此，有必要在系统水平上分析药物与疾病相关的基因、蛋白和信号通路的生物学过程，以揭示与其疗效相关的作用机制。本研究中发现，黄芪-熟地黄药对主要富含槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、豆甾醇(sitosterol)和谷甾醇(stigmasterol)等19个活性成分。槲皮素具有多种生物学活性。郑红等[6]的研究结果发现，槲皮素可通过上调去势骨质疏松症大鼠的骨形态发生蛋白-2、Smad4水平，促进成骨细胞分化，并可抑制破骨细胞的骨吸收过程，诱导破骨细胞凋亡，维持骨代谢稳定。顾艺婧等[7]的研究结果发现，槲皮素可清除衰老的骨髓间充质干细胞(BMSC)，促进BMSC的增殖及分化，防治雌激素缺乏性OP。山柰酚具有雌激素活性，可通过刺激雌激素信号转导，激活WNT/β-catenin信号通路诱导成骨细胞分化而发挥治疗作用[8]。豆甾醇和谷甾醇均属于植物甾醇类化合物，具有雌激素活性，其中β-谷甾醇是目前研究的热点之一。已有研究结果显示，β-谷甾醇可以诱导卵巢颗粒细胞E2的形成，推动骨细胞膜雌激素受体结合促进成骨过程，并且可以直接刺激成骨细胞OPG mRNA的表达，抑制破骨细胞分化因子的分泌，双向调控骨代谢动态平衡[9]。由图2可知，槲皮素、山柰酚、豆甾醇和谷甾醇等有效成分作用于多个靶点，而IL-6、TNF、TP53、VEGFA、NOS3、MAPK1、ESR1、JUN、PTGS2和EGF等作用靶点也能与多个活性成分相互作用，提示黄芪-熟地黄药对的有效成分之间存在协同调控作用。

PPI网络显示，IL-6、JUN、VEGFA、TNF、TP53、MAPK1、MAPK8、IL-1β、EGF和PTGS2等是黄芪-熟地黄药对治疗的核心靶点。IL-6、TNF和IL-1β等炎症因子的表达参与调控细胞的生长、分化等各方面，能够发挥抗炎、免疫调节等作用，影响OP、腰椎间盘突出症和膝骨关节炎等退行性疾病的发生和进展[10]。JUN属于转录因子AP-1家族，最新研究结果显示，JUN可以通过增加骨祖细胞的数量促进骨形成[11]；在此基础上，Sun等[12]提出通过调节JUN的活性促进成骨可以作为OPF的一种潜在治疗方法。VEGFA(血管内皮生长因子A)在骨骼损伤修复过程中发挥着特异性作用。Buettmann等[13]的研究结果发现，VEGFA可显著促进髓内血管生成及成骨细胞分化，可作为OP及OPF的有效治疗靶点之一。TP53(肿瘤蛋白P53)可影响细胞周期、DNA修复和细胞凋亡等多种生物学过程。Jia等[14]的研究结果发现，TP53 Arg72Pro多态性与OP的发病风险密切相关。上述核心靶点的相互作用、共同调节可能是黄芪-熟地黄药对抗OP的作用机制。本研究所聚焦的相关靶点可考虑作为今后实验研究的重要关注对象。

KEGG通路富集分析结果提示，黄芪-熟地黄药对可通过上下游多条通路，作用于成骨细胞、破骨细胞和骨髓间充质细胞等，从影响细胞增殖、分化，炎症反应和代谢等多种层面调节骨代谢平衡，从而发挥抗OP的作用。(1)细胞增殖、分化相关通路：成骨细胞-破骨细胞间相耦联的骨形成-骨吸收动态过程中的负平衡是OP发生和进展的主要病理成因及临床治疗关键点，与此相关的信号通路主要包括AGE/RAGE信号通路、动脉粥样硬化信号通路和MAPK信号通路等。其中，AGERs与受体AGE结合可激活P38MAPK、ERK1/2和JNK等多种细胞内信号级联，激活核因子κB(NF-κB)，促进破骨细胞的形成和分化，影响骨重塑过程，同时增加IL-6、TNF-α等炎症因子的表达，参与炎症细胞转导和破骨细胞自噬的过程，影响OP进展[15]。动脉粥样硬化信号通路可通过调控NF-κB信号通路、MAPK信号通路等下游通路调节骨稳态状态，维持骨代谢平衡[16]。活化的MAPK可通过促进成骨细胞的生成，抑制破骨

图8 KEGG 通路富集分析气泡图

细胞分化，发挥抗OP的治疗作用[17]。(2)炎症相关通路：炎症因子可诱导并加速OP的发生和进展而发挥重要作用，与此相关的信号通路主要涉及IL-17信号通路、TNF信号通路等[18]。IL-17是一种重要的炎症细胞因子，可通过JAK2/STAT3信号通路促进RANKL的表达，加速骨吸收[19]。IL-17与其受体结合后可通过MAPK、NF-κB等途径诱导或协同其他炎症因子(如IL-6、IL-1β和TNF-α)发挥促炎效应，可诱导骨组织产生一氧化氮合酶(NOS)及基质金属蛋白酶，抑制基质修复成分的产生，加速骨组织破坏[20]。TNF信号通路介导的慢性炎症是OP发病和治疗过程中的重要途径。研究结果发现，TNF信号通路可通过调控其下游通路如MAPK信号通路、NF-κB信号通路和凋亡信号通路等影响骨重建过程[21]。(3)代谢相关通路：内分泌失调可引起患者雌激素水平降低，导致成骨细胞和破骨细胞比例失衡，骨形成和骨吸收间呈负平衡，骨转换加快[22]。郭鱼波等[23]的研究结果发现，乳腺癌患者接受内分泌辅助治疗如芳香化酶抑制剂后可导致体内雌激素水平明显降低，骨量加速丢失，继发内分泌相关性OP，甚至发生OPF，极大威胁患者的生命健康。此外，富集程度较高的KEGG信号通路还包括人巨细胞病毒感染信号通路、南美锥虫病和鼠疫感染等信号通路，上述通路与OP的相关性尚缺乏文献支持，仍需进一步研究论证。

综上所述，本研究基于网络药理学的研究方法，初步揭示了黄芪-熟地黄药对所富含的槲皮素、山柰酚、豆甾醇和谷甾醇等多种活性成分可能通过AGE-RAGE信号通路、动脉粥样硬化信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路和内分泌失调信号通路等集中作用于IL-6、JUN、VEGFA、TNF、TP53、MAPK1、MAPK8、IL-1β、EGF和PTGS2等靶点基因，通过影响机体成骨细胞和破骨细胞的增殖、分化，炎症反应和代谢等途径，调节骨形成-骨吸收的动态平衡，维持骨代谢稳态。本研究仅通过网络药理学的方法预测黄芪-熟地黄药对治疗OP的潜在作用机制，上述结论及具体作用机制仍需进一步实验研究论证。