时间分辨荧光免疫层析法定量检测稻谷中的镉

张海涛 祁苏娴 董曼佳 陆廷瑾 杨婷婷

(江苏省苏微微生物研究有限公司，无锡 214063)

近年来，我国重金属污染粮食的事件频发，引起了全社会的广泛关注。水稻是我国第一大粮食作物，全国约65%人口以稻谷为主食，因此，稻谷的安全品质与人类健康密切相关，长期食用被镉污染的粮食，造成人体内重金属镉的富集，对体内的脏器造成负担，特别是肾脏、肝脏等的病变，还会导致神经系统的损害[1]。我国食品安全国家标准GB 2762—2017中关于稻谷中镉的限量标准为0.2 mg/kg。但是稻谷中镉超标的现象时有发生，因此研究稻谷中镉的检测方法意义重大。目前，重金属镉的常规检测方法[4]主要包括：原子吸收光谱法(AAS)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)等[1-4]，这些方法测定准确，精密度高，但设备昂贵，前处理繁琐耗时，试样需进行消解，对人员素质要求较高，不能满足基层检测单位快速检测的要求。所以迫切需要建立一种快速、方便、准确和低成本的可实现批量样本快速筛查的检测方法，从而满足粮食收购过程监控、现场监督、检查的工作需要。免疫分析法与上述几种分析方法相比具有操作简便、特异性好、分析检测成本低廉的优点，目前已报道的免疫分析方法大多胶体金试纸条或者ELISA法[5,6]，而且多用于环境样本中重金属的检测，而采用时间分辨免疫荧光层析法检测粮食中的重金属鲜有报道。本研究在前期真菌毒素时间分辨免疫荧光层析卡的研发基础上[7，8]，开发了重金属镉的时间分辨免疫荧光层析定量检测卡，可用于稻谷中重金属镉的快速定量检测。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

SW-2时间分辨荧光检测仪，GL-21M高速冷冻离心机，HS-3垂直混匀仪(超声机JP-100T，BPG-9240A精密鼓风干燥箱，HM3035三维划膜喷金仪，CTS300数控裁条机，ZQ2000自动斩切机。

1.2 试剂与材料

碳二亚胺(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA)；乙二胺四乙酸(EDTA)；Cd-EDTA-BSA偶联物、抗Cd-EDTA单抗；羊抗鼠IgG；铕Eu3+纳米微球；硝酸纤维素膜；样品垫；吸水纸；PVC底板；重金属镉标准溶液(1 000μg/mL)、有证标准物质(糙米粉)；其他糙米样品(通过ICP-MS定值)。

1.3 实验方法

1.3.1 抗Cd-EDTA单抗的荧光纳米微球标记

将铕Eu3+纳米微球超声分散10 min后，取出100 μL于2 mL 圆底离心管中，加入900 μL超纯水混匀，并超声分散5 min。分别配制50 mg/mL NHS与EDC的乙醇溶液，各取50 μL加入混合液中，混匀后于垂直混匀仪上室温旋转混匀40 min，15 000r/min离心30 min，去除上清液，加入1 mL超纯水，超声5 min使微球分散。于活化后的微球悬液中加入0.2 mg抗Cd-EDTA单抗，置于垂直混匀仪上室温反应2 h，加入BSA使之最终质量分数为0.5%，封闭1 h，15 000 r/min离心30 min，去除上清液，加入1 mL复溶液超声分散后2～8 ℃冷藏备用。

1.3.2 荧光免疫试纸条的组装

通过实验条件筛选，确定最佳包被抗原、羊抗鼠IgG的工作浓度以及荧光抗体的工作浓度。用三维划膜喷金仪将包被抗原和羊抗鼠IgG分别包被于NC膜上，形成检测线(T)和质控线(C)。将一定浓度的荧光标记抗体喷涂于结合垫上，上述NC膜和结合垫于45 ℃鼓风干燥箱中干燥24 h以上。以PVC胶粘板作衬板，将层析膜粘贴在衬板的中央。将样品垫、结合垫、吸水纸分别粘贴在层析膜的两端，并且两垫之间有1～2 mm的交联。将组装好的试纸条大板用自动斩切机切割成宽4 mm、长60 mm的板条，装于塑料卡壳中，用压壳机压紧。放入带干燥剂的铝箔袋中，连续封口机封口后，常温保存。

1.3.3 检测原理

重金属Cd时间分辨荧光免疫层析定量检测卡应用竞争抑制免疫层析的原理，样本中若含有重金属Cd，会先与样品稀释液中的EDTA形成螯合物(即Cd-EDTA)，在侧向移动的过程中会与荧光微球标记的特异性单克隆抗体反应，从而抑制抗体和NC膜检测线(T)上的抗原(Cd-EDTA-BSA偶联物)的结合。随着样本中Cd含量的升高，结合于检测线上的抗体量减少，相应的检测线荧光强度也随之变弱。使用专用时间分辨荧光免疫层析检测仪读数，可定量的测出样本中Cd的含量。

1.3.4 标准曲线的建立

配制0.01 mol/L的pH为7.2的磷酸盐缓冲液，加入0.5%的吐温-20和1 mg/L的EDTA，以此作为样品稀释液，将Cd标准品1 000 μg/mL 用上述样品稀释液定容配制成1 000 ng/mL的标准储备溶液；再逐步稀释成浓度分别为0、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10、20 ng/mL的标准工作溶液。分别取100 μL加至试纸条的样品孔中，室温(25±5)℃下反应10 min，由低浓度到高浓度进行检测，采用时间分辨荧光仪检测T线与C线荧光强度，计算T/C值。以标准工作溶液浓度的自然对数值(lnC)为横坐标，各浓度标准液的T/C值与0 ng/mL标准液的T0/C0值的比值所得百分比为纵坐标，建立标准曲线。

1.3.5 样品前处理

准确称1.0 g粉碎均匀样本至15 mL离心管中，量取5 mL 1 mol/L的稀硝酸溶液，至漩涡混匀器上涡旋提取3min，于离心机中4 000 r/min离心5 min，得上清液。移取500 μL上清液于1.5 mL离心管中，加入20 μL 5 mol/L 的NaOH溶液，至漩涡混匀器上涡旋混匀，吸取50 μL上述混匀液于1.5 mL离心管中，再加入950 μL样品稀释液至其中，至漩涡混匀器上涡旋混匀，1 min内待检。

1.3.6 方法的技术参数1.3.6.1 灵敏度

1.3.6.2 检出限与定量限

1.3.6.3 准确度

准确度依据与标准样品标定值的检测偏差判定，用正确度表示。采用有证标准物质，分别根据步骤1.3.5和1.3.4进行处理和检测，平行测定不低于6次。根据时间分辨荧光分析仪测得的T/C值，由标准曲线得出检测浓度，按式(1)计算正确度：

正确度=检测均值/样本标定值×100%

(1)

与仪器法检测比对:采用制备好的时间分辨荧光免疫层析卡与ICP-MS方法分别对六个浓度梯度的糙米样品进行双试验检测，采用配对t检验法比较两种方法的检测结果是否存在显著差异性。

1.3.6.4 精密度

精密度依据批内精密度，指同一批次产品检测同一样本结果的重复性，用变异系数(CV)表示，根据式(2)计算。采用三个浓度水平的有证标准物质，具体步骤同1.3.6中准确度测定的方法。根据所得测定结果，计算变异系数(CV值)。

变异系数(CV)=标准差/检测均值×100%

(2)

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

建立的重金属Cd的标准曲线，在0.1～5 ng/mL浓度范围内，有效剂量值即抑制率在85.1%～21.8%，线性回归相关系数R2达0.994 6，直线方程y=-0.161 1x+0.497 5。由此，确定标准曲线的线性范围，并以此作为以下实验的线性浓度。

2.2 方法的技术参数

2.2.1 灵敏度

表1 重金属Cd灵敏度的测定

2.2.2 检出限与定量限

表2 重金属Cd检出限与定量限的测定

2.2.3 准确度

采用3个不同含量水平的有证标准物质，按照步骤检测，测定结果如表3所示，可见正确度在81.0%～91.7%之间，变异系数(CV)均在15%以下。糙米中重金属Cd的测试结果见表4，层析卡测定的td= 1.02，经查t分布表，t0.05,5=2.570 6，td值未超过查表值，说明测定结果与ICP-MS方法测定结果之间无显著性差异。

表3 重金属Cd正确度的测定(n=6)

表4 糙米样品重金属Cd测定准确性/mg/kg

2.2.4 精密度

采用同一批次层析卡，采用3个浓度水平的有证标准物质，测定结果见表3，通过测定值计算得出的变异系数在5.1%～7.7%之间，均低于10%，说明精密度良好。

3 结论

本研究在前期真菌毒素时间分辨免疫荧光层析卡的研发基础上，开发了重金属镉的时间分辨免疫荧光层析定量检测卡，该方法检测重金属镉，样品前处理简单、快速，与传统仪器法测定相比安全系数较高。对所建立的方法进行了一系列参数优化，该方法的检出限和定量限分别为0.026 mg/kg和0.064 mg/kg，对有证标准物质的检测回收率在81.0%～91.7%之间，对实际样本的检测与ICP-MS检测结果一致性较高。

所建立的时间分辨免疫荧光试纸条操作简单，样本处理过程只需稀酸简单提取和稀释后即可测定，整个操作过程大约需要20 min，配套小型经济、便携的荧光分析仪，适用于大量样本的快速初步筛查，从而满足粮食收购过程监控、现场监督、检查的工作需要。