NCAPD3通过EZH2促进前列腺癌发生发展

刘倩梅,柯 敏,何馨媛,景作磊,刘 平

(南京师范大学生命科学学院,生物化学与生物制品研究所,江苏 南京 210023)

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性中最常见的非皮肤型恶性肿瘤[1],严重威胁男性生命健康. 据美国癌症协会统计,前列腺癌已经成为导致美国男性癌症死亡的第二大病因[2]. 就中国癌症情况分析,2020年前列腺癌新发病例12万,虽明显低于欧美国家,但随着高龄人口的增多、生活和饮食习惯的改变,前列腺癌发病率和死亡率呈明显上升趋势[3].

NCAPD3定位于11q25,包含37个外显子序列,全长共1 498个氨基酸,有4个HEAT重复结构域和一个coiled-coil结构域[4],是凝缩蛋白复合物II(Condensin II)的非SMC调节亚基之一,在细胞有丝分裂过程中扮演了重要的角色,主要负责染色体的凝缩和分离. NCAPD3的功能异常可能导致染色体凝缩中断,并导致分离错误. 研究发现,当NCAPD3缺失后,细胞核的结构和大小都会发生很大改变[5];果蝇中NCAPD3发生突变,会导致染色体凝缩和分离存在缺陷[6],不能形成离散的染色体区域[7]. 此外,NCAPD3与肿瘤的发生、发展也密切相关. 有报道称,NCAPD3的表达与前列腺癌根治术后肿瘤复发有关,与肿瘤病理分期、Gleason分级和术前PSA水平无关,提示NCAPD3是一个新的前列腺癌预后因子[8].

EZH2是多梳蛋白抑制复合物2(polycomb repressive complex2,PRC2)的核心成员,其生物学功能主要是抑制靶基因的转录. 具体机制主要包括以下两种:第一种是EZH2发挥H3K27甲基转移酶活性[9],第二种是EZH2与表观遗传修饰酶合作[10]. 研究表明,EZH2在多种恶性肿瘤中均高表达,典型的有前列腺癌、乳腺癌、胃癌等. Matsika等通过免疫组化对前列腺癌组织中的EZH2进行了染色,发现EZH2的表达与分化指数和淋巴结的转移有关[11];EZH2可以促进前列腺癌细胞的增殖和转移,且激素非依赖型前列腺癌中的EZH2蛋白的表达要高于激素依赖型[12],因此EZH2可以作为前列腺癌诊断和预后的指标以及一个新的治疗靶点. 有关NCAPD3与EZH2的关系仍未见报道,本研究旨在探讨前列腺癌中NCAPD3对EZH2的影响.

1 材料方法

1.1 材料

RPMI 1640培养基购自维森特生物技术(南京)有限公司;胎牛血清购自美国Gibco公司;胰蛋白酶(Trypsin)购自索莱宝生物科技公司;质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司;免疫组化试剂盒购自博士得生物科技公司;预染蛋白Marker购自Themo Fisher公司;Trizol、Lipofectmine 2000购自美国Invitrogen公司;HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)、SYBRE® Premix Ex Taq TM购自南京诺唯赞生物有限公司;NCAPD3、STAT3、EZH2抗体购自Proteintech公司;β-actin、AR抗体、Cy3 标记的荧光二抗、FITC标记的荧光二抗购自ABclonal公司;Enzalutamide购自Sigma公司.

1.2 实验方法

1.2.1 临床样本和细胞系

收集江苏省中医院行机器人辅助腹腔镜前列腺癌切除术的前列腺癌组织及癌旁组织,所有患者均提供书面知情同意书. 正常前列腺上皮细胞WPMY-1、良性增生前列腺细胞BPH-1以及4种前列腺癌细胞PC-3、DU145、CWR22Rv1、LNCaP购自中国科学院上海细胞库.

1.2.2 细胞培养及传代

细胞培养使用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基,放置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养. 细胞传代时使用0.25%的胰蛋白酶消化,3 d～4 d传代一次.

1.2.3 细胞转染

细胞消化后计数种板,待细胞长至密度为70%左右时,按质粒:lipofectmine 2000=2 μg:3 μL的比例进行转染. 用RPMI 1640基础培养基分别稀释转染试剂lipofectmine 2000和质粒DNA,轻轻混匀后静置 5 min,然后将稀释后的质粒加入到稀释后的转染试剂中,再次轻轻混匀,静置18 min,将上述混合物均匀滴加在含RPMI 1640基础培养基的细胞中,培养箱中孵育6 h左右,更换为含10%胎牛血清的完全培养基,继续培养48 h.

1.2.4 蛋白免疫印迹(Western blotting)实验

按照RIPA:PMSF:cocktail=9∶1∶0.1的比例配制蛋白裂解液,将蛋白裂解液加入到细胞沉淀中,置于冰上放置40 min,每隔10 min涡旋一次,以充分裂解细胞. 12 000 rpm,4 ℃离心18 min,吸取上清,所得即为蛋白. 用DC法对蛋白进行定量,取20 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳. 电泳结束后,将蛋白质转印至PVDF膜上,用含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭90 min;封闭完成后用1×PBST清洗3次,一抗4 ℃孵育过夜. 第二天用1×PBST清洗3次后,二抗室温孵育90 min,最后将ECL显影液滴加在PVDF膜上,置于化学发光显影仪中拍照.

1.2.5 RNA提取和实时定量PCR实验

用Trizol提取细胞的总RNA,用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)试剂盒逆转录1 μg总RNA,使用StepOne Plus系统和SYBR green染料进行实时定量PCR(qRT-PCR),检测目的基因的mRNA表达水平.

1.2.6 免疫组化(Immunohistochemical)实验

肿瘤组织离体后尽快放入4%多聚甲醛中固定过夜,经梯度脱水后进行石蜡包埋和切片;切片依次进行二甲苯脱蜡、梯度酒精复水、通透及封闭内源性过氧化物酶、微波高温抗原修复、血清封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色、苏木素复染、梯度酒精脱水、中性树脂封片,晾干;最后用倒置荧光显微镜观察并拍照.

1.2.7 免疫荧光(Immunofluorescence)实验

将细胞计数后接种到12孔板中,1×105个/孔;转染处理48 h后,用4%的多聚甲醛固定30 min,0.1% Triton X-100室温通透25 min,3% BSA室温封闭30 min,4 ℃过夜孵育一抗;PBS洗3次,37 ℃避光孵育荧光二抗1 h,避光孵育DAPI 5 min染核,荧光显微镜下观察并拍照.

1.2.8 统计分析

采用SPSS 17.0软件对实验结果进行统计分析,使用ttest分析实验数据,通过(Mean±SEM)来表示.P<0.05表示具有统计学意义,用*表示;P<0.01表示差异显著,用**表示;P<0.001表示差异极显著,用 *** 表示. 使用GraphPad Prism 6.0和PhotoShop软件作图.

A:GEPIA网站分析前列腺肿瘤组织与正常组织中NCAPD3水平;B:GEPIA网站分析前列腺肿瘤组织与正常组织中EZH2水平;C:ASSISTANT for Clinical Bioinformatics网站分析TCGA数据库中前列腺肿瘤组织与正常组织中NCAPD3水平;D:ASSISTANT for Clinical Bioinformatics网站分析TCGA数据库中前列腺肿瘤组织与正常组织中EZH2水平.图1 NCAPD3和EZH2在前列腺癌组织中高表达Fig.1 NCAPD3 and EZH2 are highly expressed in prostate cancer tissues

2 结果与讨论

2.1 NCAPD3和EZH2在前列腺癌组织中高表达

利用GEPIA网站(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析前列腺肿瘤组织与正常组织中NCAPD3与EZH2的表达情况,发现NCAPD3与EZH2在前列腺癌组织中的表达水平都明显高于邻近正常组织(如图1 A,B所示). 利用ASSISTANT for Clinical Bioinformatics网站(https://www.aclbi.com/static/index.html#/)分析TCGA 数据库前列腺肿瘤组织与正常组织中NCAPD3与EZH2的表达情况,结果发现NCAPD3与EZH2在前列腺癌组织中的表达水平都明显高于邻近正常组织(如图1 C,D所示),进一步验证上述结果. 综上,NCAPD3和EZH2在前列腺癌组织中高表达.

2.2 NCAPD3和EZH2在前列腺癌细胞和临床组织样本中高表达

通过数据库分析,发现NCAPD3和EZH2在前列腺癌组织中高表达,因此,进一步在细胞水平和临床组织水平进行验证. 提取正常前列腺上皮细胞WPMY-1、良性增生前列腺细胞BPH-1以及4种前列腺癌细胞PC-3、DU145、CWR22Rv1、LNCaP的蛋白,采用Western blot实验检测NCAPD3和EZH2在以上6种细胞系中的表达情况. 结果表明,NCAPD3和EZH2的蛋白水平在WPMY-1和BPH-1中较低,在4种前列腺癌细胞系中高表达(如图1 A,B,C所示). 提取上述6种细胞的RNA,采用RT-PCR实验检测NCAPD3和EZH2在以上6种细胞系中的mRNA水平,结果与蛋白水平一致(如图1 D所示). 收集前列腺癌组织及邻近正常组织,通过免疫组化检测NCAPD3和EZH2在前列腺癌临床样本中的表达情况,结果显示,NCAPD3和EZH2在前列腺癌组织中的染色强度均明显高于邻近正常组织(如图1 E,F所示). 综上,得出结论:NCAPD3和EZH2在前列腺癌细胞和临床组织样本中均高表达,提示两者存在一定的相关性.

A:Western blot检测NCAPD3和EZH2在正常前列腺上皮细胞系、良性增生前列腺细胞系和4种前列腺癌细胞系中的表达情况;B:对图A中NCAPD3的量化分析图;C:对图B中EZH2的量化分析图;D:RT-PCR检测NCAPD3和EZH2在正常前列腺上皮细胞系、良性增生前列腺细胞系和4种前列腺癌细胞系中的表达情况;E:免疫组化检测NCAPD3在前列腺癌组织和邻近正常组织中的表达情况;F:免疫组化检测EZH2在前列腺癌组织和邻近正常组织中的表达情况.图2 NCAPD3和EZH2在前列腺癌细胞和临床组织样本中高表达Fig.2 NCAPD3 and EZH2 are highly expressed in prostate cancer cells and clinical tissues

2.3 NCAPD3可以调节EZH2的表达

为了探究NCAPD3是否可以调节EZH2的表达,在PC-3及DU145细胞中过表达NCAPD3,检测EZH2蛋白水平变化情况. 结果发现,过表达NCAPD3后,EZH2的蛋白水平明显上调(如图3 A所示). 为了进一步验证,在CWR22Rv1及LNCaP细胞中敲低NCAPD3,检测EZH2蛋白水平变化情况. 结果发现:敲低NCAPD3后,EZH2的蛋白水平明显下调(如图3 B所示). 在PC-3或CW22Rv1细胞中分别过表达或敲低NCAPD3,通过RT-PCR检测EZH2 mRNA水平变化情况. 结果显示:过表达NCAPD3后EZH2的 mRNA 水平升高,敲低NCAPD3后EZH2的mRNA水平降低(如图3 C所示),表明NCAPD3可以在转录水平调节EZH2的表达. 免疫荧光实验结果表明,在PC-3细胞中过表达NCAPD3后,EZH2的荧光强度明显变强,而在CW22Rv1中敲低NCAPD3后,EZH2的荧光强度变弱(如图3 D所示). 综上,发现NCAPD3可以在转录水平调节EZH2的表达.

A:在PC-3和DU145细胞中过表达NCAPD3,通过Western blot检测EZH2蛋白水平变化情况;B:在CWR22Rv1和LNCaP中敲低NCAPD3,通过Western blot检测EZH2蛋白水平变化情况;C:在PC-3和CWR22Rv1细胞中过表达或敲低NCAPD3,通过qRT-PCR检测EZH2 mRNA水平变化情况;D:在PC-3和CWR22Rv1细胞中过表达或敲低NCAPD3,通过免疫荧光检测EZH2荧光强度变化情况.图3 NCAPD3可以调节EZH2的表达Fig.3 NCAPD3 can regulate the expression of EZH2

2.4 前列腺癌中存在AR-NCAPD3-EZH2信号通路

有研究发现,AR和EZH2在前列腺癌的发生、发展过程中发挥了重要的作用,本实验室前期已经证实NCAPD3受AR调控. 为了进一步证实AR、NCAPD3、EZH2三者之间的关系,在PC-3细胞中过表达AR,发现NCAPD3及EZH2的蛋白水平都有所上调(如图4 A所示). 为了进一步验证上述结果,在CWR22Rv1细胞中过表达AR,检测NCAPD3及EZH2的蛋白水平变化情况,结果与图4 A一致(如图4 B所示). 在CWR22Rv1中敲低AR,检测发现NCAPD3及EZH2的蛋白水平都有所下调(如图4 C所示). Enzalutamide是雄激素受体信号传导的抑制剂,通过竞争性阻断雄激素与其受体的结合而发挥作用,已被批准用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌患者. 使用不同浓度的Enzalutamide处理LNCaP细胞,发现NCAPD3及EZH2都呈浓度依赖的方式下调,进一步证实二者受AR调控(如图4 D所示). 综上,AR可以调节NCAPD3和EZH2的表达,并通过NCAPD3-EZH2信号通路促进前列腺癌的发生发展.

A:在PC-3细胞中过表达AR,检测NCAPD3及EZH2的蛋白水平变化情况;B:在CWR22Rv1细胞中过表达AR,检测NCAPD3及EZH2的蛋白水平变化情况;C:在CWR22Rv1细胞中敲低AR,检测NCAPD3及EZH2的蛋白水平变化情况;D:分别使用浓度为(0、5、10、15)μmol/L的Enzalutamide处理LNCaP细胞,检测AR、NCAPD3及EZH2蛋白水平变化情况.图4 前列腺癌中存在AR-NCAPD3-EZH2信号通路Fig.4 AR-NCAPD3-EZH2 signaling pathway exists in prostate cancer

3 结论

前列腺癌是目前全球男性中最常见的恶性肿瘤之一,具有发病率高、起病隐匿等特点,出现相关病症时往往已伴有局部浸润或远处转移. 前列腺癌的早期诊断和治疗十分重要,在早期诊断方面,PSA检测大大提高了前列腺癌的诊出率,但其低特异性也造成了过度医疗,因此,新型肿瘤标志物的研究成为一大热点. 此外,就病因学角度而言,引发前列腺癌发生、发展的分子机制十分复杂,涉及的分子信号通路和分子网络以及引起病变的因素众多,需要更深入的大量的基础研究来不断完善.

在细胞分裂过程中,基因组的正确分离是所有生物生存的先决条件,凝缩蛋白复合物是此任务的主要控制者[13]. 有研究发现,凝缩蛋白复合物中亚基的功能异常或表达异常与癌症的发生密切相关[14-16]. 凝缩蛋白有多种亚基,目前的研究均较少. 本实验室前期通过临床组织样本的转录组测序分析了NCAP家族成员,发现NCAPD3在前列腺癌组织中高表达. 利用Western blot和IHC检测,进一步验证NCAPD3在前列腺癌细胞及临床组织中高表达. 暗示:NCAPD3的异常高表达与前列腺癌的发生发展密切相关. 此外,EZH2作为一种表观遗传修饰酶在多种癌症中发挥着促癌作用. 有研究发现,EZH2可以促进前列腺癌细胞的增殖和转移,有望作为前列腺癌诊断和预后的指标以及一个新的治疗靶点[13]. 由此可见,在前列腺癌中进行关于NCAPD3及EZH2的研究是很有必要的. 本研究发现,NCAPD3和EZH2在前列腺癌细胞和组织中均高表达,且NCAPD3可以调节EZH2的表达. 但是,NCAPD3调节EZH2表达的具体分子机制尚不清楚,需要进一步探究.

AR在前列腺癌的发生、发展过程中发挥了重要的作用,过表达或敲低AR后发现NCAPD3、EZH2的表达相应地上升或下降. Enzalutamide作为雄激素受体抑制剂,于2018年被美国FDA批准用于治疗去势抵抗性前列腺癌,不同浓度的Enzalutamide处理可使NCAPD3和EZH2呈浓度依赖性下调,进一步证实AR可以调节NCAPD3和EZH2的表达,且提示AR可通过NCAPD3-EZH2通路促进前列腺癌的发生发展.

综上所述,NCAPD3在前列腺癌的发生发展中扮演了重要的角色,相关的机制研究结果为不断完善前列腺癌的分子病因学提供实验依据,也为前列腺癌的治疗提供新的潜在的分子靶点.