毛细管电泳分离分析氨基酸虚拟仿真实验设计及应用*

孔 宇，刘 宇，张艳英，李 华，孙书洪，亓树艳，姜 曼

(1 西安交通大学 生命科学与技术学院 陕西省生命科学实验教学示范中心，陕西 西安 710049;2 北京微瑞集智科技有限公司，北京 100000)

毛细管电泳技术是生化分析领域一种常见的分离分析方法，其原理是待分离物质因荷质比等理化性质不同，在毛细管内的直流电场中差速迁移而得到分离。与传统分离方法相比，毛细管电泳有着需样量小、效率高、分离周期短等优点，在生化分析领域有较强的应用优势，是生化类专业学生需要掌握的一项必要的技术。然而在实际教学过程中，因毛细管电泳仪价格昂贵、普及率低，操作难度高等因素的限制，实体实验很难开展，影响了学生实验技能的培养[1-2]。因此，开发毛细管电泳相关的虚拟仿真实验，可充分发挥虚拟仿真实验不受时间、空间限制，容错，低成本等优势[3-4]，可使学生近距离“接触”毛细管电泳仪，不受限制地学习仪器工作原理，掌握仪器操作技能，巩固理论课程知识，提升实验教学效果。

项目拟以生化分析实验中的氨基酸分离分析实验为背景，开发基于毛细管电泳技术的虚拟仿真实验，虚拟仿真实验项目中实验虚拟场景采用使用Maya和3DMax软件进行整体实验室3D建模；虚拟实验操作利用Unity3D平台进行三维操作设计[5]，通过Mysql进行数据收集和管理，最终建立基于B/S架构的毛细管电泳虚拟仿真实验系统，详细如下。

1 基于培养目标的毛细管电泳虚拟仿真实验内容设计及实现

氨基酸分离分析技能是“生化分析实验”中学生应掌握的核心内容之一，要求学生在掌握氨基酸的性质(如等电点、分子量、极性、官能团等)的基础上，学会利用常见分离分析方法完成混合氨基酸样本的分离分析。而生化类实验中涉及的常见分离分析方法有纸层析[6]、液相色谱[7-8]等，均存在氨基酸需衍生化，多组分同时分离难，实验操作照方抓药、学生参与度低、积极性差等不足，限制了实验的效果。因此在开发虚拟仿真实验操作界面和设计实验内容时，紧扣大纲要求[9]、针对上述瓶颈，发挥虚拟仿真实验的优势，并结合“两性一度”相关设问，提升学生能力培养，以期达到最佳效果。

1.1 学生应掌握的重要知识点和技能分析

1.1.1 物质(氨基酸)等电点及带电性计算：

等电点和物质带电性的计算(以氨基酸为例)是生化分析类课程的重要知识点之一。课程中要求学生将理论课程中的相关知识应用于氨基酸带电性质的判断和计算上，即掌握等电点计算原理(分为酸性、中性、碱性、侧链基团解离等四大类)和推导、使用计算公式(如式1)。此外，在掌握等电点计算的基础上，对学生提出高阶性问题：如何计算给定pH下氨基酸(可拓展至两性物质)的带电荷数量？相应计算原则及公式(pKa>或

等电点计算公式：

pI=1/2(pKa1+pKa2)

(1)

当pH

(2)

当pH>pKa2时，氨基酸带有负电荷，氨基酸所带负电荷E2，可用式3表示。

(3)

1.1.2 毛细管电泳的原理及影响毛细管电泳分离的因素

毛细管电泳原理方面：需掌握电渗流产生的机制、荷电物质在毛细管内的分离特点。影响毛细管电泳分离分析的条件因素方面：需掌握pH、缓冲液浓度、电压、温度、毛细管长度等因素对分离的影响。涉及计算公式如式4，式5所示。

VEOF=μE=ε0εξE=Lef/tEOF

(4)

式中：VEOF为电渗流速率，ε0为真空介电常数，ε为介电常数ξ为毛细管壁的Zeta电势，E为场强，Lef为毛细管有效长度，tEOF为电渗流标记物(中性物质)的迁移时间。

(5)

式中：V为离子迁移速率，q为离子带电荷数，r为离子半径，η为溶液粘度。

1.1.3 实验方案设计能力和实验数据分析能力

虚拟仿真实验结果输出形式为电泳图和各物质迁移时间、峰高、峰宽、峰面积等参数，实验中要求学生能利用所得参数进行数据处理，获得分离柱效、分离度等衡量分离策略优劣的评判参数，结合条件实验进行分离策略的优化；此环节着重提升学生的分析解决问题的能力。参考的计算公式如式6，式7所示，此部分内容在虚拟仿真实验原理部分展示。

(6)

(7)

式中：N为柱效，t为迁移时间，w1/2为半峰宽。

1.1.4 毛细管电泳仪的操作流程及注意事项

需学生了解毛细管电泳仪器部件构成，掌握包含开机、毛细管安装、光纤连接、样品摆放、方法编辑、条件选择、运行分离过程、结果比对分析、关机等操作步骤，明确注意事项。

1.2 针对教学核心目标的虚拟实验设计及实践

1.2.1 网站总体界面及功能

虚拟仿真实验网站设计时，考虑应支撑教学前、实验后等环节，增强教学效果。除实验部分(开始实验)外，设计了申报视频(实验教学视频)，预习测试(针对实验原理学习效果)，填写报告(提交实验报告，也可由系统自动生成)，实验结果(用于学生回收实验数据及结果)，实验须知(实验注意事项等)环节。为增进互动，开设了通知公告，师生交流、练习数值等栏目，网页主界面见http://xjtu.dlvrtec.com网页。

1.2.2 核心教学目标的实现

1.2.2.1 氨基酸等电点、带电性的计算和分离pH的设计

在原理讲述部分设有公式推导的教学课件，由学生自行学习，推导相应公式。在实验时，为避免学生之间因相互借鉴而降低实验挑战度，随机给每个学生分配5种氨基酸，由学生各自独立计算出所分配氨基酸的等电点(知识应用能力考查)，并设计分离缓冲液的pH(综合设计能力)，同时计算该pH下，给定5种氨基酸的带电荷情况(挑战度题目，教师有全pH各氨基酸带电荷情况表和excel版氨基酸带电荷情况自动计算表格)。此环节中，学生自主完成公式的推导和应用，教师依据学生设计条件确定是否正确，是否可行。

1.2.2.2 毛细管电泳的原理及影响毛细管电泳分离的因素的学习

通过幻灯片形式展示毛细管电泳原理，通过设置配套选择题来检验学生学习效果。依据学习基础，结合上一步骤学生的氨基酸带电程度计算结果和选定pH，学生可自由对其他毛细管电泳条件进行设置。本虚拟仿真实验将常见的影响毛细管电泳分离效果的参数，如电压、缓冲液浓度、毛细管有效长度等，均纳入模拟范围，实现对学生方案设计能力的全面考查。

1.2.2.3 结果的分析与方案修正

完成上述毛细管电泳分离得到实验结果后，学生首先学会电泳峰参数(峰面积、峰高、迁移时间)的采集和柱效、分离度等分离效果评价指标的计算方法，然后依据评价指标确定是否达标。若实验结果不理想(如分离度不符合要求等)，允许学生返回参数设置界面，重新设置新参数，再次尝试，直至得到理想结果为止。图1为学生针对不理想的实验结果(图1B、1D)，对电压、温度等因素调节前后分离情况变化对比图(图1A、1C为较理想的分离图)。从图1可以看出，虚拟仿真软件可实时针对设定参数动态预测分离结果。此过程亦可实现学生分析、解决问题的能力培养。

图1 虚拟实验结果示例图

1.2.2.4 虚拟实验操作训练

虚拟仿真实验高真实度构建了涵盖开机、卡套安置、光纤安装、样品摆放、方法编辑、条件选择、运行、结果比对、方案修正、关机等步骤的实验体系，简要如图2所示。通过学习和虚拟实验操作，学生可熟悉并掌握毛细管电泳仪器的操作基本流程和注意事项，为实体实验打下基础。

图2 实验操作流程示例图

2 交互性操作步骤说明

为增强实验效果，设置了多处提问互动点，如实验前讲述毛细管电泳的相关基础知识，针对这些基础知识提出相应的思考问题，加深学生对基础知识的理解和掌握，为后续的实验开展提供理论支持。实验过程中，针对实验中的一些现象亦有互动式交流与提问。又如毛细管电泳过程中的每个参数(缓冲液pH值/分离电压/温度/氨基酸分子量等)在理论上如何影响分离结果(高阶性问题)等等。在实验操作过程中，学生可点击上边框流程栏，随时了解所在实验环节的要求及在整个流程中的定位和完成情况。此外，虚拟仿真实验还设置了容错及有偿(获得提示的同时，上边框中得分值会自动减少)提示功能，保障学生对实验流程整体的掌握，满足不同教学要求。

3 应用情况

基于氨基酸分离的毛细管电泳虚拟仿真实验从2019年开始运行，已有110余位学生使用，通过率90%。学生评价优良。抗击疫情期间，支撑学院硕士研究生和本科生毕业论文中毛细管电泳的分离理论模拟工作，预测结果与实际分离分析结果相似度高。程序开发和设计工作亦有本科生参与，并获批软著权专利2份。

4 结 语

开发的毛细管电泳虚拟仿真实验依据毛细管电泳的理论，以氨基酸的分离分析为教学背景，参考大量实验数据，回归得到了多个理论参数，编写程序较准确地预测和还原了真实实验结果；基于unity的VR操作实现了高真实度的仪器操作和互动，非常有利于学生操作能力的训练和基于实验数据分析问题、设计解决方案的能力。后续将增加毛细管电泳在线堆积技术等其他毛细管电泳分离模式的模拟，开发手机版程序等，并将实验项目推广至分析化学类专业的VR教学中。