过滤对超速离心法提取外泌体的影响

李 榕 陈 静 李传云 周 童 陈 欢 陈德喜 乔跃兵* 李伟华*

(1. 承德医学院人体解剖与组织胚胎学教研室，河北承德 067000; 2. 首都医科大学附属北京佑安医院肝病研究所，北京 100069; 3. 首都医科大学附属北京佑安医院外科中心，北京 100069; 4. 中南大学湘雅公共卫生学院，长沙 410078)

外泌体(exosome) 是由细胞分泌的膜性小囊泡，直径30～150 nm[1]。外泌体包含有蛋白质、RNA和DNA等多种成分[2-3]，在细胞信号传递、细胞迁移、血管新生、免疫反应和肿瘤细胞生长等方面具有重要的作用[4-7]。由于外泌体是纳米级的颗粒，非常小，目前仍没有特异的分离纯化方法。超速离心法作为外泌体提取的“金标准”是最常用的提取和纯化手段[8]。有研究[9-10]报道在超速离心提取外泌体时，先用0.22 μm滤器过滤，认为这样可以去除标本中的大分子物质，容易获取外泌体。但过滤对外泌体的提取数量有何影响？是否提高了外泌体的纯度？相关报道较少。本实验通过纳米颗粒追踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)方法和Amnis量化成像流式检测外泌体特异性抗体CD9、CD63的方法，检测过滤前后外泌体的数量及在总颗粒中的百分比，分析经0.22 μm滤膜过滤对超速离心法提取外泌体数量及纯度的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI-1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、0.25%(质量分数)胰蛋白酶(trypsin-EDTA)、5 U/mL 青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin solution)和磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)均购自美国 Gibco公司；肺癌PC-9/IR细胞 (南京科佰生物科技有限公司)；FITC-CD9和PE-CD63抗体购自美国 BD公司；0.22 μm滤器(美国 Millipore公司)；Amnis量化成像流式分析仪(法国 Millipore公司)；超速离心机和超滤管(美国 Beckman Coulter公司，Optima XPN-100)；超敏激光共聚焦显微镜(德国Leica公司,TCS-STED-3X)；纳米颗粒跟踪分析仪(德国 Particle Metrix公司,ZetaView)；透射电子显微镜(日本Hitachi公司,Hitachi-7650)；纳米流式检测仪(厦门福流生物科技有限公司,NanoFCM)。

1.2 方法

1.2.1 血浆标本留取

收集2020年10月至12月首都医科大学附属北京佑安医院健康查体样本6例，每例样本留取全血10 mL。本研究经过首都医科大学附属北京佑安医院伦理委员会批准，批准文号：京佑科伦理[2021]034号。所有志愿者均签署知情同意书。

1.2.2 PC-9/IR细胞培养

PC-9/IR细胞是人肺癌细胞，易培养，可分泌大量外泌体，因此本实验选用此细胞上清的外泌体作为研究对象。含1%(质量分数)青霉素-链霉素和10%(体积分数)FBS的RPMI-1640培养基于37 ℃、5%(体积分数)CO2培养箱中培养PC-9/IR细胞，0.25%(质量分数)胰蛋白酶消化传代。

1.2.3 血浆外泌体的提取

取全血10 mL，300g离心10 min，去除细胞；取上清，1 000g离心10 min，去除死细胞；取上清，4 ℃ 2 000g离心30 min，去除细胞碎片；取上清， 4 ℃ 10 000g离心30 min，去除凋亡小体等较大的囊泡；取上清，置于SW32Ti贝克曼超速离心管中，加入适量PBS，4 ℃ 110 000g离心70 min；重复上一步；弃上清，外泌体(沉淀)重悬于400 μL PBS中备用。

1.2.4 培养上清外泌体的提取

PC-9/IR细胞培养上清外泌体提取方法同血浆外泌体的提取方法。

1.2.5 外泌体过滤

收集好的外泌体，平均分为2组，过滤组(fitration group, GL)使用0.22 μm 滤器将外泌体过滤后进行NTA和Amnis量化成像流式检测，未过滤组(unfiltration group,NC)直接进行NTA和Amnis量化成像流式检测。

1.2.6 纳米颗粒追踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)

用PBS调节外泌体至1×107粒/mL～1×109粒/mL，纳米颗粒跟踪分析仪采用激光照射外泌体悬浮液，并对外泌体颗粒的散射光进行检测，通过统计散射颗粒的数量来计算纳米颗粒浓度。同时，追踪纳米颗粒布朗运动的轨迹，计算出单位时间纳米颗粒的均方位移(mean squared displacement,MSD)，并根据结果得出纳米颗粒粒径分布图。

1.2.7 外泌体抗体染色

将过滤后的外泌体平均分配到2个1.5 mL的EP管中，标记为GL-CD9组和GL-CD63组;未过滤的外泌体平均分配到2个1.5 mL EP管中，标记为NC-CD9 组和NC-CD63组。在两组标记CD9和CD63的管中，分别加入10 μL FITC-CD9、 PE-CD63抗体。置于冰上，避光染色40 min。然后将其分别转移至超离管中，加入PBS，4 ℃ 110 000g离心70 min，洗掉未结合的抗体。使用100 μL PBS重悬沉淀并转至1.5 mL EP管中，避光，备用，实验设计及技术流程见图1。

图1 技术流程图Fig.1 Experimental technology programePBS: phosphate buffer solution; NC: unfiltration group; GL: filtration group.

1.2.8 Aminis量化成像流式分析

采用ImageStreamX软件收集100 000个粒子。在量化成像流式分析系统上获取数据，使用IDEAS®软件统计分析CD9+Exo和CD63+Exo的数量及CD9+Exo和CD63+Exo在总粒子中的百分比。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 外泌体的鉴定

透射电镜观察到外泌体的形态和结构(图2),超敏激光共聚焦显微镜观察到外泌体特异性标志物CD9-AF647标记的外泌体(图3),纳米流式检测外泌体的平均粒径为62 nm左右(图4)。

图2 外泌体电镜图片Fig.2 Exosomes picture of electron microscope(Scale bar=200 μm)

图3 外泌体超敏激光共聚焦显微镜图片(CD9-AF647)Fig.3 Exosomes picture of ultra-sensitive confocal laser microscope(CD9-AF647)

图4 纳米流式检测外泌体Fig.4 Nanometer flow cytometer detection of exosomes

2.2 纳米颗粒跟踪分析检测过滤组与未过滤组外泌体粒径及数量的变化

NTA结果显示，超速离心法提取纳米粒径主峰值集中在67～77 nm(表1，图5A～D)，与外泌体体积(30～150 nm)大小相符。过滤前、后血浆外泌体粒径分别为83.31 nm和80.74 nm，培养上清外泌体粒径分别为94.11 nm和88.62 nm。2组外泌体粒径过滤前、后差异无统计学意义(P>0.05)。血浆外泌体未过滤组数量为9.44×1010个/mL，过滤组为2.01×1010个/mL，相差约4.7倍(图5E)。培养上清外泌体未过滤组数量为12.21×1010个/mL，过滤组为4.82×1010个/mL，相差约2.5倍(图5F)。血浆及培养上清过滤组外泌体数量明显下降，与未过滤组比较差异有统计学意义(P<0.01)。过滤对血浆外泌体的减少大于培养上清。

表1 NTA检测血浆和培养上清中过滤组与未过滤组纳米颗粒的粒径及数量

图5 NTA检测过滤前后外泌体数量变化倍数Fig.5 Fold changes of exosomes before and after filtration by NTA detectedA: Exosome size distribution in plasma unfiltered group; B: Exosome size distribution in plasma filtration group; C: Exosome particle size distribution of culture supernatant unfiltered group; D: Exosome particle size distribution of culture supernatant filtration group; E: The ratio of the number of exosomes between the unfiltered group and the filtered group of plasma samples; F: The ratio of the number of exosomes in the culture supernatant between the unfiltration group and the filtration group. **P<0.01, ***P<0.001 vs Baseline; NC： unfiltration group; GL： filtration group; NTA: nanoparticle tracking analysis.

2.3 Amnis量化成像流式检测过滤组与未过滤组外泌体数量及纯度的变化

CD9和CD63是外泌体特异性标志，用FITC-CD9和PE-CD63单抗对外泌体进行标记， Amnis量化成像流式进行检测，IDEAS®软件统计CD9+Exo和CD63+Exo的数量及CD9+Exo和CD63+Exo在总粒子中的百分比(图6)。

图6 Amnis量化成像流式检测CD9+和CD63+外泌体Fig.6 CD9+ and CD63+ exosomes determined by Amnis flow cytometry

Amnis量化成像流式结果显示，血浆未过滤组CD9+Exo、CD63+Exo和总粒子的数量分别为(8.15±2.13)×106/mL、(3.62±0.71)×106/mL和(32.09±5.80)×106/mL，过滤组为(1.63±0.86)×106/mL、(1.39±0.44)×106/mL和(14.01±2.06)×106/mL，分别下降了5倍、2.6倍和2.3倍。培养上清未过滤组中CD9+Exo、CD63+Exo总粒子的数量分别为(3.23±0.70)×106/mL、(31.33±6.28)×106/mL和(121.10±22.70)×106/mL，过滤组为(1.01±0.21)×106/mL、(13.88±3.00)×106/mL和(60.60±10.86)×106/mL，分别下降了3倍、2.3倍和2倍，详见表2。各过滤组与未过滤组相比差异均统计学意义(P<0.05) (图7A、7B) 。以上数据显示，过滤可以明显降低外泌体提取的数量。

表2 Amnis量化成像检测CD9+Exo和CD63+Exo的数量及百分比

血浆中未过滤组与过滤组CD9+Exo分别占总粒子数的21.23%和8.49%，CD63+Exo分别占总粒子数的14.77%和10.63%。培养上清中未过滤组与过滤组CD9+Exo分别占总粒子数的20.77%和7.99%，CD63+Exo分别占总粒子数的13.36%和13.07%。以上各过滤组与未过滤组相比除CD9+Exo明显下降外(P<0.05)，CD63+Exo和总粒子组差异无统计学意义(P>0.05) (图7C、7D)。以上数据显示，过滤后，CD9+Exo和CD63+Exo在粒子中的百分比(外泌体的纯度)并没有提高反而有所下降。

图7 过滤对外泌体数量及纯度的影响Fig.7 Effects of filtration on the quantity and purity of exosomes A: The number of CD9+ Exo, CD63+ Exo and total particles between plasma filtration group and unfiltration group; B: The number of CD9+ Exo, CD63+ Exo and total particles between the filtered group and the unfiltered group; C: The percentage of CD9+ Exo, CD63+ Exo in total particles between plasma filtration group and unfiltration group; D: The percentage of CD9+ Exo, CD63+ Exo in the total particles between the filtered group and the unfiltered group. *P<0.05 vs NC group; NC： unfiltration group; GL： filtration group.

3 讨论

外泌体已成为医学和生命科学领域研究的热点，获得高纯度的外泌体对后续研究至关重要。超速离心法是目前外泌体最常用和有效的提取方法[11]，由于外泌体体积极小，其提取的纯度和生物活性很容易受到离心力、离心时间等外界因素的影响[12]，因而寻找与其相适应的提取方法是开展外泌体研究的前提。

外泌体体积约30～150 nm，理论上使用0.22 μm滤膜过滤对其数量不会产生明显影响。本实验数据显示，使用0.22 μm过滤膜过滤后明显降低了外泌体纳米提取的数量，过滤组与未过滤组相比，外泌体数量下降了2～5倍。分析原因可能有以下2点：第一，外泌体在血浆和培养上清中可能黏附体积较大的大分子(如蛋白质或细胞碎片)，这些大分子在过滤过程中被清除，黏附在上面的外泌体也被清除。第二，文献[13]报道，每毫升血浆中大概有109个外泌体，浓度非常大，在如此大浓度下，外泌体有可能彼此之间黏附聚集成团，这些团块在过滤时被清除，因而降低了外泌体的数量。另外，本实验数据显示，过滤使血浆比培养上清中外泌体下降更多，这一结果从另一方面验证了第二点推测的可能性。

为了明确过滤是否提高了外泌体的纯度，笔者使用外泌体特异性抗体CD9和CD63对外泌体进行标记，使用Amnis量化成像流式[14-15]对标记的抗体进行检测。Amnis量化成像流式MKII的激光功率高，灵敏度高，利用 Amnis 可以检测到直径 20 nm 微珠的荧光信号[16]，并可以拍摄到直径为 100 nm 的微珠的图像。 因此，Amnis 量化成像流式的灵敏度和图像分辨率可以检测直径范围在 30～100 nm 的外泌体。结果显示，过滤组CD9+Exo、CD63+Exo以及总颗粒都有明显下降，与NTA结果一致。进一步分析CD9+Exo和CD63+Exo在颗粒中的百分比并没有提高，也就是说过滤并没有提高外泌体的纯度。其原因可能是使用0.22 μm滤器处理样本后，外泌体聚集的团块被过滤，CD9+Exo和CD63+Exo数量下降。CD9+Exo和CD63+Exo百分比也随之下降，因此过滤并未提高外泌体的纯度。

不管是基础实验研究还是临床疾病诊断，获取足够数量、高纯度的外泌体是研究其功能、内容物及作用机制的一个重要前提。虽然过滤会减少外泌体的获取数量，但由于超速离心法在反复离心的过程中会导致外泌体污染，0.22 μm过滤膜可以去除细菌。如提取外泌体后，后继实验需要无菌操作(如用外泌体与细胞共培养等)，过滤仍是最好的选择。因此，在外泌体提取过程中，可以根据实验需求决定过滤和不过滤。