子宫内膜异位症相关卵巢癌患者上皮-间充质转化相关蛋白的表达及其影响因素

付小英，吕海利，刘平，尚莹莹

西安国际医学中心医院妇科，西安 710061

研究证实，子宫内膜异位症（endometriosis，EMS）及其潜在的恶变能力与部分卵巢癌间存在密切联系，目前临床将这类卵巢癌单独定义为子宫内膜异位症相关卵巢癌（endometriosis-associated ovarian cancer，EAOC）。上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞转变为间质细胞的病理过程，其在EMS向EAOC转变的过程中发挥重要作用，而上皮钙黏蛋白（E-cadherin）、神经钙黏蛋白（N-cadherin）、锌指转录因子Snail均是EMT相关的重要物质。本研究旨在探讨EAOC患者病灶组织中EMT相关蛋白表达情况及其与患者临床特征间的相关性，以期为EAOC致病机制的研究提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年8月至2021年4月于西安国际医学中心医院治疗的EAOC患者及单纯EMS患者。纳入标准：①均于西安国际医学中心医院接受手术治疗；②符合EAOC或单纯EMS诊断标准；③近6个月无激素使用史。排除标准：①术前行化疗或其他治疗；②合并其他恶性肿瘤；③合并其他内分泌疾病；④病历资料不全。根据纳入与排除标准，本研究共纳入60例EMS患者及60例EAOC患者，收集EMS组织及EAOC组织。EAOC组年龄≥60岁34例，＜60岁26例；病理类型：卵巢透明细胞癌29例，子宫内膜样癌31例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期41例；淋巴结转移36例。

1.2 试验试剂

兔人E-cadherin单克隆抗体（ab40277）、兔人N-cadherin多克隆抗体（ab18203）、兔人Snail多克隆抗体（ab180714）。

1.3 免疫组织化学染色法及结果判定

采用免疫组织化学链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法处理组织，具体方法如下：石蜡组织进行4 μm的连续切片，将切片贴附于挂胶片上，使用67℃烤片机烤1 h，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱苯水化，使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗3次，每次冲洗3 min。冲洗结束后使用pH=8.0的乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）修复液进行高压修复，修复时间为2 min。自然冷却至室温后，PBS冲洗3次，每次冲洗3 min。使用3%的双氧水封闭10 min阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次冲洗3 min。去除PBS后，滴加对应工作浓度的抗体试剂，在37℃的温箱中孵育1 h，PBS冲洗3次，每次冲洗3 min。去除PBS后，滴加抗体工作液，室温孵育22 min，PBS冲洗3次，每次冲洗3 min。使用二氨基联苯胺进行显色，直至显微镜下出现棕黄色颗粒时，终止显色，之后充分水洗，苏木素复染细胞核，梯度酒精脱水，再使用二甲苯透明。

结果判断：E-cadherin、N-cadherin蛋白阳性为细胞膜出现黄色颗粒，Snail蛋白阳性为细胞核和（或）细胞质内出现黄色颗粒。每张切片在高倍镜（×400）下随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，观察细胞染色强度与阳性细胞百分比。染色强度评分标准：无黄色颗粒记0分，淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分；染色阳性细胞百分比评分：≤25%为1分，＞25%且≤50%为2分，＞50%且≤75%为3分，＞75%为4分。染色强度与阳性细胞百分比相乘为积分，根据染色结果评估积分，其中0～2分为阴性，积分≥3分为阳性，其中3～4分为弱阳性，5～8分为阳性，≥9分为强阳性。

1.4 观察指标

比较两组患者各自组织中E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白阳性表达率。统计不同临床特征EAOC患者蛋白阳性表达率，并对其进行多因素分析，分析不同蛋白阳性表达与患者临床特征的相关性。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 EMT相关蛋白阳性表达情况的比较

EAOC组织中E-cadherin蛋白阳性表达率低于EMS组织，而N-cadherin及Snail蛋白阳性表达率均高于EMS组织（

P

＜0.05）。（表1）

表1 两组患者EMT相关蛋白阳性表达情况的比较[ n（%）]

2.2 EAOC患者EAOC组织中EMT相关蛋白阳性表达影响因素的单因素分析

不同年龄、病理类型EAOC患者EAOC组织中EMT相关蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）。临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的EAOC患者EAOC组织中E-cadherin蛋白阳性表达率均高于临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（

χ

=60.00、41.71，

P

＜0.05）；临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的EAOC患者EAOC组织中N-cadherin蛋白阳性表达率均低于Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（

χ

=6.16、15.13，

P

＜0.05）；无淋巴结转移的EAOC患者EAOC组织中Snail蛋白阳性表达率低于有淋巴转移患者，差异有统计学意义（

χ

=5.68，

P

＜0.05）。（表2）

表2 EAOC患者EAOC组织中EMT相关蛋白阳性表达影响因素的单因素分析（ n=60）

2.3 EAOC患者EAOC组织中EMT相关蛋白阳性表达率影响因素的多因素分析

将单因素分析中差异有统计学意义的临床分期（Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1）、淋巴结转移（有=0，无=1）作为自变量，EMT相关蛋白的阳性表达作为因变量纳入多因素Logistic回归分析，结果显示，临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移均是E-cadherin蛋白阳性表达的独立危险因素（OR=1.531，95%CI：1.166～2.011，

P

＜0.05）、（OR=1.425，95%CI：1.047～1.938，

P

＜0.05）；临床分期不是N-cadherin蛋白阳性表达的影响因素，无淋巴结转移是N-cadherin蛋白阳性表达的独立危险因素（OR=1.533，95%CI：1.100～2.135，

P

＜0.05）；无淋巴结转移是Snail蛋白阳性表达的独立危险因素（OR=1.612，95%CI：1.041～2.496，

P

＜0.05）。

2.4 EAOC患者EMT相关蛋白阳性表达与其临床特征相关性分析

Spearman相关性分析显示，EAOC患者EAOC组织E-cadherin蛋白阳性表达与其临床分期及淋巴转移情况呈负相关（

r

=-0.36、-0.44，

P

＜0.05），而N-cadherin蛋白阳性表达与其临床分期及淋巴转移情况呈正相关（

r

=0.42、0.37，

P

＜0.05），Snail蛋白阳性表达与其淋巴转移情况呈正相关（

r

=0.34，

P

＜0.05）。

3 讨论

EMT是EMS侵袭与转移的重要机制，研究EMT相关蛋白与EAOC的关系可进一步阐释EAOC致病机制，对疾病的治疗及预防起着至关重要的作用。EMT是指上皮细胞转变为间质细胞的过程，上皮细胞具有明显的极性及紧密的黏附性，而间质细胞则缺乏极性并具有较强的运动性，当上皮细胞丧失极性，间质细胞获得转移能力时，细胞开始进入EMT状态。

近年来，有许多研究发现，EMT不仅与伤口愈合、胚胎形成、器官纤维化等反应相关，其还在恶性肿瘤增殖、侵袭与转移中发挥重要功效。黏蛋白参与细胞生长、分化、延伸及移动，而E-cadherin、N-cadherin及P-cadherin均属于经典黏蛋白。E-cadherin是维持上皮细胞表型的单次跨膜糖蛋白，是细胞间重要的黏附分子，N-cadherin主要参与神经细胞的选择，并在促进神经管形成中发挥功效。锌转录因子Snail是促使EMT发生的关键因子，并能促进E-cadherin蛋白表达。总而言之，E-cadherin、N-cadherin及Snail在EMT中均发挥重要作用。而E-cadherin表达下调，N-cadherin及Snail表达上调是EMT促进上皮源性肿瘤发生的公认标志改变。本研究发现，与单纯的EMS组织相比，EAOC组织中E-cadherin蛋白阳性表达率降低，而N-cadherin及Snail蛋白阳性表达率均上升，与上述研究结论相吻合。Logistic回归分析结果显示，临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移是E-cadherin蛋白阳性表达的独立危险因素，无淋巴结转移是N-cadherin、Snail蛋白阳性表达的独立危险因素，表明临床分期、淋巴结转移对EAOC患者EMT相关蛋白水平存在不同影响。

本研究Spearman相关性分析显示，EAOC患者EAOC组织E-cadherin蛋白阳性表达与其临床分期及淋巴转移情况呈负相关（

r

=-0.36、-0.44，

P

＜0.05），而N-cadherin蛋白阳性表达与其临床分期及淋巴转移情况呈正相关（

r

=0.42、0.37，

P

＜0.05），Snail蛋白阳性表达与其淋巴转移情况呈正相关（

r

=0.34，

P

＜0.05）。但由于本研究样本量有限，未能对EMT相关蛋白间的相互作用进行分析，后续应对此方面进行深入研究。

综上所述，EAOC患者EAOC组织与EMS患者EMS组织中E-cadherin、N-cadherin及Snail蛋白阳性表达差异显著，且经Spearman相关性分析，E-cadherin、N-cadherin及Snail蛋白阳性表达与EAOC患者临床分期及淋巴转移有一定相关性，说明EAOC的进展可能与EMT相关蛋白的表达存在密切联系。