响应面法优化竹叶青茶末中茶氨酸的提取工艺

兰 林，汪晟羽，张晋森，袁 源，钱叶迁，谢 玲，李玉锋*，李笃新

1.西华大学 食品与生物工程学院，四川 成都 611730；2.四川大观梁生态农业科技有限公司 四川 巴中 636000

竹叶青茶（Bamboo leaf tea）属于众多茶类中的一种，生长于“秀甲天下”的峨眉山，有着世界公认的产茶黄金地带[1]。茶叶中含有多种人体所需的微量元素，近年来，一些国内、外的科学家均发现茶对健康的有益影响，如防癌、保护心血管、降血压、调节免疫力等[2-6]。随着茶产业的发展和人们需求的变化，茶副产物不断增多。近年来，随着茶叶深加工的不断发展，剩余茶废料得到有效利用，提取和分离纯化得到多种生物活性物质。

茶氨酸（L-theanine）是茶叶中特有的非蛋白氨基酸，占茶叶游离氨基酸总量的50%左右，是茶汤主要的呈味物质之一[7]，其保健功能和药理作用不断被发掘，并成为茶叶功能成分开发利用的热点之一。有关研究表明，茶氨酸是一种安全、无毒、具备多种生物活性成分，具有延缓衰老、降血压、镇定、增强记忆力和减少焦虑或抑郁等功效[8-12]；目前茶氨酸已在食品的添加、功能性保健产品的开发、疾病的防御等多个邻域有广泛应用[13-14]。但据研究报道，与天然茶氨酸相比，合成的茶氨酸体内生物活性低[15]。因此，提取茶叶中的茶氨酸成为研究重点之一。目前，已有较多方法应用于茶氨酸的提取，如超临界CO2萃取法提取[16]、利用超声辅助提取[17]、利用复合酶法提取分离[18]、利用某些有机或无机试剂可与氨基酸形成不溶性反应物的特性分离法[19]及运用超滤膜法富集分离茶氨酸[20]等。但这些方法存在或多或少的问题，如微波辅助提取，提取率不能得到显著提升；沉淀法操作复杂，对环境不友好，且容易造成茶氨酸损失；膜法分离技术的特点是工艺简单、无相变，用于茶氨酸的初步提取，得到的茶氨酸纯度不高等。综合考虑采用离子交换层析法成本低廉，原料易得，树脂可以循环反复使用，绿色且环保，操作不难和收率高[21]。本试验以竹叶青茶末为研究对象，采用响应面法优化竹叶青茶末中茶氨酸提取工艺条件，为竹叶青茶末中茶氨酸的提取开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

竹叶青茶末，会园茶厂，四川乐山；磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、碳酸钠、水合茚三酮，天津市致远化学试剂有限公司；茶氨酸标品，源叶生物科技有限公司；NKA-II树脂、大孔吸附树脂AB-8，天津光复精细化工研究所；PA6树脂、PA66树脂，山东优索化工科技有限公司。

1.2 仪器与设备

高速粉碎机，永康皇代五金制品有限公司；BPG-9070A恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器；Molecular Devices SpectraMaxi3 X型多功能酶标仪及HHS-数据恒温水浴锅，美谷分子仪器有限公司；BT 423S电子天平，北京赛多斯科学仪器。

1.3 试验方法

1.3.1 茶氨酸的提取

参照曹博等[22]的方法。取一定量的竹叶青茶末用粉碎机制成茶粉，称取1 g过60目筛的茶粉放入烧杯中添加蒸馏水搅拌均匀，水浴锅里浸提一定时间后提取茶汤备用。

超滤浓缩：选择4种不同截留分子量的超滤离心管，截留分子量分别为100 KD、50 KD、10 KD、3 KD，对浸提后的茶汤进行超滤浓缩。

树脂吸附：首先将 PA6、PA66、AB-8、NKA-II树脂用超纯水浸泡，通过浮选的树脂用浓度为0.5 mol/L的HCl溶液浸泡24 h，冲洗至中性，用75%的乙醇溶液浸泡24 h，超纯水冲洗至浑浊液出现，用质量分数为2% NaOH溶液浸润24 h，用95%的乙醇沉淀，采取湿法上柱方式，沉淀后经冷冻干燥后即得茶氨酸。

1.3.2 标准曲线绘制

参照周国兰[23]等人采用茚三酮检测法，取1 mL待测样液于试管中，加入500 μLpH值为8的磷酸缓冲液和500 μL质量分数为2%的茚三酮溶液，在100℃水浴下沸腾15 min，待自然冷却，加水定容至25 mL。放置10 min，取1 mL于24孔板中，570 nm测定OD值。配制浓度为0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的茶氨酸标准液，每组试验平行三次。并以浓度为X轴、OD值为Y轴绘制标准曲线。

1.3.3 单因素试验

分别选用不同孔径的目筛过滤茶末（20目、40目、60目、80目、100目）、提取温度（60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）、提取时间（20 min、40 min、60 min、80 min、100 min）和液料比（1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30）进行单因素试验，考察各因素对茶氨酸提取率的影响，确定最佳提取工艺。

1.3.4 响应面试验

在单因素试验基础上，采用Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken设计试验组合，分别选取液料比（A）、提取时间（B）和提取温度（C）对茶氨酸得率影响显著的三因素进行三因素三水平的响应面法优化试验（表1）。

表1 响应面水平和因素设计Table 1 Response surface level and factor design

1.3.5 数据分析

采用Origin 9.0软件进行试验图表绘制，采用Design-Expert 8.0.6统计软件进行响应面优化分析。

2 结果与分析

2.1 茚三酮标准曲线

结果见图1。根据分析得到线性回归方程式：Y= 0.1216X+0.0068，R2= 0.9995，可见，线性关系良好。

图1 茚三酮标准曲线Figure 1 Standard curve of ninhydrin standard

2.2 单因素试验结果

2.2.1 液料比对茶氨酸提取率的影响

由图2可知，在提取温度80℃、提取时间60 mim、蒸馏水中提取条件下，随着液料比增加到1∶15时茶氨酸含量达到最大，随后便降低。因此，考虑绿色环保等因素，试验选用液料比为 1∶15。

图2 液料比对茶氨酸提取率的影响Figure 2 Effect of liquid material ratio on the extraction rate of theanine

2.2.2 提取温度对茶氨酸提取率的影响

由图3可知，随着提取温度的升高，茶氨酸提取率呈现先增加后降低的趋势，80℃时达到最高。因此，试验选择80℃为最佳提取温度。

图3 提取温度对茶氨酸提取率的影响Figure 3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of theanine

2.2.3 提取时间对茶氨酸提取率的影响

由图4可知，随着提取时间的增加，茶氨酸提取率逐渐上升，60 min时达到最高，后随着提取时间的延长迅速降低。因此，试验选取提取时间为60 min最佳。

图4 提取时间对茶氨酸提取率的影响Figure 4 Effect of extraction time on the extraction rate of theanine

2.3 响应面优化试验

试验结果见表2。利用Design-Expert 8.0.6软件对上表2试验中所得数据建立二次回归方程分析，得到回归模型：Y=2.84+0.051A+0.11B+0.14C-0.02AB+0.022AC+0.03BC-0.3A2-0.11B2-0.21C2。响应面回归模型的方差分析结果见表3。实验所选模型P= 0.0002 < 0.05，模型具有极显著性；由F= 2.53，失拟项P值= 0.1959 > 0.05，失拟项不显著；R2Adj= 0.9264，拟合程度良好。此模型测试误差小，说明模型试验值和预测值有很好的相关性。

表2 响应面试验设计方案及试验结果Table 2 Response surface test design scheme and test results

表3 响应面回归模型结果方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface regression model results

为了更好研究各变量之间的关系，基于上述回归方程结果，利用响应面软件进行可视化分析，绘制响应曲面图和等高线图如图5所示。由图5可看出：随着液料比和提取时间的增加，茶氨酸提取率逐渐增高，且交互作用坚强，响应面曲面较陡；液料比和提取温度等高线呈现较圆且等高线较短交互作用不明显；提取时间和提取温度对茶氨酸提取率交互效应次之。试验提取参数对茶氨酸提取的影响程度从大到小依次为提取温度>提取时间>液料比。

图5 各因素交互作用对茶氨酸提取得率的响应面及等高线图Figure 5 Response surface and contour plots of the interaction of various factors on the theanine extraction rate

2.4 验证试验结果

基于践行节约资源降低成本的原则，为验证模型的准确性，采用单因素试验和响应面进行验证，根据试验结果确定竹叶青茶末中茶氨酸提取的最佳工艺为液料比15∶1、提取温度80℃和提取时间60 min，进行3次重复试验验证，得到茶氨酸提取率为44.12%，与试验预测值较为接近，表明试验模型可靠。

3 结论

在单因素试验基础上结合Box-Behnken中心组合设计原理模型的分析方法对竹叶青茶末中茶氨酸提取工艺进行优化，建立液料比、提取温度和提取时间与茶氨酸的回归模型。结果表明，模型具有较高显著性合理可靠，最后得出最佳提取工艺参数为液料比1∶15、提取温度80℃和提取时间60 min。在此工艺参数的验证试验下茶氨酸得率为44.12%，且纯度为91.23%（根据QB/T 4263—2011方法检测），与响应面的预测结果有较好的一致性，说明运用响应面法优化竹叶青茶末中茶氨酸的提取工艺可行，可为茶叶中茶氨酸的提取与开发利用提供一定的参考。