通过ACEⅡ通路治疗男性不育症的中药网络药理学研究

王璐，李海松，王继升，冯隽龙，邓省，鲍丙豪，赵 琦，王彬

（北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

近年来，男性不育症的发病率逐年升高，相关研究表明：在国外一些地区，12%～18%的育龄夫妻处于不育状态；国内不育患者的比率接近10%，其中半数为男方因素导致[1-2]。约75%的患者表现为少弱精子症，本病属于多种因素共同导致，相关发病机制目前尚未研究明确，临床上主要进行对因治疗，辅助应用激素等药物，疗效差强人意，存在一定的不良反应[3-4]。对本病的发病机制进行研究，提高临床疗效是目前迫切需要解决的问题。随着对男性不育症研究的不断深入，肾素-血管紧张素通路被发现可能与相关类型的睾丸炎症相关[5]。网络药理学根据药物-靶点-疾病的关联构成网络，对药物作用机制进行阐释的现代研究方法，通常应用于辅助研究药物对疾病的作用机制。本研究从已知的通路入手，利用中药多成分、多靶点的特性，针对ACEⅡ通路和少弱精的交集靶点，运用网络药理学方法，探索治疗的有效中药及活性化合物，以期针对肾素-血管紧张素通路对生精功能潜在的具有治疗及保护作用的中药。

1 材料与方法

1.1 ACEⅡ通路靶点检索

通过KEGG数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, www.kegg.jp）检索肾素-血管紧张素通路（检索词：Renin-angiotensin system,ID:ko04614）。下载通路中靶点名称及相关通路图。

1.2 少弱精子症相关靶点检索

通过Genecards数据库（https://www.genecards.org/）检索少弱精子症（检索词：oligospermia,asthenospermia），下载相关靶点后，与检索到的ACEⅡ通路靶点取得交集，视为新冠肺炎通过肾素-血管紧张素系统对少弱精子症产生影响的靶点。

1.3 有效中成药筛选

运用中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php）检索交集靶点，筛选并下载相关的有效中药，并记录各中药的总靶点数，以及共同靶点数。

1.4 中药活性化合物筛选

根据交集靶点，通过TCMSP筛选出中药活性化合物，并从DrugBank数据库（www.drugbank.ca）中确认出活性化合物的有效作用靶点，记录共同靶点数。

1.5 有效中药-活性化合物-靶点网络的构建

汇总筛选得出的交集靶点、有效中药、以及中药活性化合物数据，运用Cytoscape3.7.0（www.cytoscape.org）软件构建有效中药-活性化合物-靶点网络，并运用NetworkAnalyzer功能分析化合物、中药、及网络构成情况。

2 结果

2.1 ACEⅡ通路靶点检索

通过KEGG数据库检索肾素-血管紧张素系统，针对ACEⅡ通路检索关键靶点名称，下载相关通路图，发现该通路中共有7个关键靶，分别为血管紧张素原（angiotensinogen, AGT）、肾素（renin, REN）、糜酶（chymase, CMA1）、组织蛋白酶G（cathepsinG, CTSG）、血管紧张素转化酶（angiotensin-convertingenzyme, ACE）、谷氨酰氨基肽酶（glutamylaminopeptidase, ENPEP）、血管紧张素Ⅱ1型受体（type-1angiotensinⅡreceptor,AGTR1）。见表1。

表1 ACEⅡ通路靶点

2.2 少弱精子症相关靶点检索

通过Genecards数据库检索出500个少弱精子症相关靶点，通过与ACEⅡ通路靶点取交集后，得到2个靶点，分别为REN和ACE。

2.3 有效中成药筛选

运用TCMSP数据平台，根据检索交集靶点，筛选并下载相关的中药，发现共有194味中药含该通路靶点。取排名前10位的有效中药（共同靶点/总靶点）如下：麻黄、桑叶、柴胡、芫荽、沙棘、桂枝、生姜、桑椹、枇杷叶、牛蒡子。见表2。

表2 与 ACEⅡ通路具有共同靶点的中药前10位

2.4 中药活性化合物筛选

通过TCMSP平台，根据检索交集靶点，筛选出中药活性化合物，并进一步从DrugBank数据库确认和下载有效作用靶点，分别为alpha-humulene,GLY, L-Ile, (-)-trans-Carveol, anethole, (S)-p-Mentha-1,8-dien-7-al, FMT, Terragon, chavicol, (1R, 2R,4R)-Dihydrocarveol, PPI, Azeton, acetic acid,(5S)-5-butyloxolan-2-one,[(4R)-4-isopropenyl-1-cyclohexenyl]methanol,Butenone,1,3-p-Menthadien-7-al,1-Vinylcyclohexanol, (5S)-3,5-dimethylcyclohex-2-en-1-one,(-)-epicatechin,见表3。

表3 ACEⅡ通路具有共同靶点的活性化合物

2.5 有效中药-活性化合物-靶点网络的构建

通 过 KEGG、TCMSP、DrugBank数 据 库，根据交集靶点，以及筛选得出的有效中药（前10位）、活性化合物，运用Cytoscape 3.7.0软件构建有效中药-活性化合物-靶点网络，并运用NetworkAnalyzer功能计算化合物、中药及网络构成情况，分析4个网络维度（Degree、Average Shortest PathLength、Betweenness Centrality、Closeness Centrality）的相关结果。发现在中药-活性化合物-靶点网络，以麻黄Degree最高（Degree=7），桑叶、芫荽次之（Degree=5），活性化合物按Degree排序以acetic acid（Degree=11）、anethole（Degree=4）、Terragon（Degree=4）居前3位。详细网络维度结果，见表4，表5。

表4 化合物-靶点网络中的有效中药

表5 化合物-靶点网络中的有效成分

3 讨论

ACE2是首个被发现的人类血管紧张素转换酶（ACE）的同源物，属于1型跨膜蛋白，广泛存在于心、肾、肺等细胞表面。肾素-血管紧张素（renin angiotensin-aldosterone system，RASS）系统是人体血管的收缩、重塑，电解质、损伤反应等的重要调节轴。其中肾素与血管紧张素原分别主要来源于肾脏与肝脏，血管紧张素原在肾素的调控下转化成血管紧张素I（AgI）。AgI通过血液循环进入肺脏，在血管紧张素转换酶的作用下分解为血管紧张素II（AgII），对血管收缩以及血压等产生调控作用，起到平衡肺部的炎症损伤、氧化应激反应等作用。研究[6-7]发现RASS系统在多种肺部疾病的治疗中，均有着重要的作用。

目前，在男性不育症的治疗中，中医药在协助人体抵抗病毒、提高人体生理机能、防治睾丸炎症、改善生育功能等方面起到了重要作用[8]。孙自学[9]认为男性不育症的主要病机是“肾虚络阻”，以“补肾益气，活血通络”法治疗男性不育症，疗效较好。陈其华[10]将精道瘀滞总结为本病主要病机，在治疗上“以通为用”，辅以补益脾肾之品，使精道得通，每获良效。

本研究构建了有效中药-活性化合物-靶点网络，发现麻黄、桑叶、芫荽的Degree排名最高。麻黄首载于《神农本草经》，具发汗解表、宣肺平喘、利水消肿功效。李俊涛等[11]认为，临床应用麻黄“振奋肾阳”功用治疗相关男性疾病，可产生明显的疗效。麻黄既可以改善精液液化情况，又可以兴奋肾上腺素能，进而改善射精功能，间接影响受孕概率[12]。药理研究发现，桑叶具有清除氧自由基的效果，而氧自由基是弱精性不育症相关机理之一，较高含量的活性氧会引起精子各运动速度参数和精子比例参数的显著下降，精子DNA完整性的显著下降，以及精子存活率的显著下降[13]。芫荽性味偏于辛温，具有解表、健胃的功效。芫荽中含有脂肪醛和脂肪醇类化合物，以及黄酮类、酚酸类及香豆素类等化学成分，具有抗菌、降血糖、抗氧化、抗焦虑、利尿等疗效[14]。

通过网络分析得到的前3位活性化合物为acetic acid（Degree =11）、anethole（Degree = 4）、Terragon（Degree = 4），且仅有 acetic acid 可同时作用于REN和ACE两个靶点。现有文献中并未有acetic acid治疗少弱精子症的报道，但是acetic acid广泛存在于有明确的治疗少弱精子症的中药当中，本化合物是基于网络药理学预测的可能具有治疗ACEⅡ通路受损的少弱精子症，但也有可能其疗效并不显著，仍需相关实验进一步验证。

睾丸具有产生精子的重要作用，但较为脆弱，容易被病毒侵袭。多种病毒均对睾丸有损伤作用，导致生育力下降，如腮腺炎病毒可以导致患儿在成年后出现不育，甚至睾丸萎缩。寨卡病毒可以在生殖系统中转录甚至在精液中存活数月，诱发男性睾丸炎以及附睾炎症。乙肝病毒、艾滋病病毒等都会影响睾丸生精功能，导致男性不育。

综上所述，本研究通过网络药理学方法，初步探究对睾丸可能具有保护及治疗作用的中药及化合物。在常规用药之外，对保护睾丸生精功能提供了新的思路，但本研究是基于网络药理学及生物信息技术的预测结果，尚未对结果进行的实验验证。