外泌体在组织修复及抗瘢痕治疗中的研究进展

史敏 毕芳芳 张明雨 陈炜荧 丁欣强

[关键词]外泌体;瘢痕;创面修复;成纤维细胞;细胞外基质

[中图分类号]R619+.6    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2021）11-0179-04

Advance in Research on Exosomes in Tissue Repair and Anti-scarring Treating

SHI Min1，BI Fang-fang1，ZHANG Ming-yu1，CHEN Wei-ying1，DING Xin-qiang2

（1.Xian Peihua University，Xian 710125，Shaanxi，China; 2.Department of Dermatology， Xi'an Children's Hospital，Xian 710003，Shaanxi，China）

Abstract： It is always the focus of treatment in dermatology and plastic surgery， such as promoting skin wound healing and reducing scar formation. In recent years， it was found that exosomes （EXOs）， as a communication tool between cells， participate in paracrine functions， and have been found to play an important role in a variety of pathophysiological processes and disease processes， and have gradually become the field of tumor immunity and research hotspots in the field of regenerative medicine. Exosomes can promote wound healing，inhibit scar formation by inhibiting early inflammation，promoting angiogenesis and cell proliferation， and regulating collagen remodeling， thereby providing a new method of promoting healing for skin wound. Exosomes have broad application prospects in wound healing and anti-scarring effects， and they are expected to open up innovative ways for wound healing and anti-scar treatment.

Key words： exosome; hypertrophic scar; wound repair; fibroblast; extra cellular matrix

伴隨着医学技术的发展，自体干细胞移植因免疫反应小且不涉及伦理问题，已广泛用于临床多种疾病的治疗。然而，干细胞在创伤愈合和组织修复中的作用与其分化能力无关，主要的机制是旁分泌作用，而旁分泌则是通过外泌体（Exosomes，EXOs）实现的[1]。外泌体是细胞分泌的一种双分子层微囊泡，包含了蛋白质、脂质、多糖及RNA等物质，可通过细胞间信号传递参与旁分泌作用，在多个领域发挥其生物活性，尤其在肿瘤免疫及再生医学领域的研究中备受关注[2]。本文就外泌体的形成、作用机制、在组织再生修复及抗瘢痕方面的作用及未来研究方向进行回顾。

1  概述

1.1 外泌体的发现及其形态学特征：外泌体为脂质双分子层微囊泡，在电镜下负染呈“盘样”“杯状”或“茶托状”，纳米颗粒跟踪分析仪显示其粒径为30～150nm，密度为1.09～1.18g/ml，于1997年被命名为exosome。早在1983年，外泌体首次被发现于绵羊网织红细胞，发现之初人们认为它只是细胞代谢中的一种废弃物，并未引起重视。直到20世纪90年代，人们才发现外泌体膜可携带Ⅰ型和Ⅱ型主要组织相容性复合体（MHC）抗原提呈分子，并参与淋巴细胞免疫。21世纪初研究发现，外泌体中的RNA可介导细胞间的遗传物质交换并翻译产生蛋白质，人们才逐渐意识到外泌体功能的重要性。近来发现，外泌体是一种特异性的亚细胞结构，几乎可由所有种类的细胞分泌，普遍存在于生物体各种细胞液及体液中，膜表面标记物有四跨膜蛋白（如：CD9、CD81、CD63等）和热休克蛋白（Heat shock protein，HSP）90、HSP70等，囊泡内富含蛋白质、脂质、核酸、多糖等生物活性分子，是细胞间通信的重要工具，在疾病发展过程中起重要作用，这些发现激发了人们对外泌体的研究热情。

1.2 外泌体的形成机制：外泌体的重要功能与其形成机制密切相关，其机制虽不明确，但现有研究认为其形成的过程大同小异[3]。首先，细胞膜或内质网系统以向内出芽的方式通过核内分选系统复合物形成早期核内体（Early endosomes），并逐渐演变为晚期核内体（Late endosome）。在miRNA、HSP及生长因子等物质进入后，分选“货物”后，晚期核内体逐渐演变成多囊泡体（Multi-vesicular bodys，MVBs）。部分多囊泡体小泡与溶酶体融合后裂解成微粒，其余多囊泡体将会在Rab27、Snare蛋白的帮助下与质膜融合（此过程称为向外出芽）成微泡，最终将其释放到胞外，形成外泌体。释放的外泌体进入循环系统，被带到其他器官或组织，作用于靶细胞，发挥生物学效应[4]。不同来源的外泌体会通过三种机制作用于受体细胞：①外泌体进入受体细胞后，将“货物”释放入胞质重新形成多泡体;②将“货物”释放入胞质，但自身与胞膜融合;③外泌体膜上的配体与靶细胞膜上受体结合，兼有信号传导作用和内吞作用，将“货物”运入胞内。

1.3 外泌体的成分：外泌体成分与其来源的母细胞有关或类似，但整体较保守，通常含以下物质：①蛋白质：是外泌体的重要成分，包括膜联蛋白和脂筏蛋白，可以运输和融合重要的蛋白质，如：参与细胞靶向的四跨膜蛋白、免疫相关的MHC类分子及HSP等;②脂质：主要包括神经酰胺、胆固醇、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂等;③核酸：RNA主要包括mRNA、miRNA和Lnc RNA等，此外还有肿瘤细胞释放的单链DNA、cDNA和转座因子等;④多糖：主要是甘露糖。截至目前，发现外泌体有9 769种蛋白质、3 408种RNA、2 838种miRNA及1 116种脂类物质[5]。这些分子与外泌体的生物学功能密不可分，并可作为疾病的生物标志物。

2  外泌体在组织修复中的作用机制

2013年，美国科学家Rothman、Schekmam和德国科学家Sudhof因细胞内部囊泡（外泌体等）合成运输调控机制的重要发现而获得诺贝尔生理学或医学奖，让以往被人们忽视的外泌体重新进入研究者的视线，推进了对外泌体成分、作用及各个领域的研究，人们发现了外泌体在免疫中抗原提呈、肿瘤的生长和侵袭、组织再生与修复等领域发挥着重要作用[6]。有研究表明[7]，外泌体参与心、肺、凝血、神经、皮肤等器官组织损伤的修复过程，并在其中起到了关键作用。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是外泌体分泌能力最强的细胞，分泌的外泌体含有大量营养因子、黏附分子、信号分子、相关抗原及miRNA等，以内分泌或旁分泌的方式促进组织修复[8]。已经证实，MSCs-EXOs含iPS诱导的各类干细胞，其包裹的miR31、miR125a作为刺激信号，可促进模型动物的创面愈合，这些功能与外泌体促进内皮细胞的增殖、迁移和血管生成有关[9]。在皮肤创面治疗方面，MSCs-EXOs可治疗大鼠皮肤深Ⅱ度烧伤，创面愈合率显著提高，可能与AKT和wnt4/β-catenin通路激活促进创面修复有关。还有文献报道[10]，脂肪MSCs-EXOs包裹的通过影响轴突再生以及NF、GAP-43和GFAP表達，显著促进脊髓损伤模型动物神经功能的恢复，从而为神经损伤治疗开拓了新途径。近年来，人们对外泌体在心血管疾病方面的研究也逐渐深入。有文献报道[11]，在心梗造模成功小鼠的梗死心肌边缘注射外泌体后，病理切片显示梗死区边缘可见新生毛细血管和增殖的心肌细胞，且4周后小鼠的心脏超声、心梗面积及运动能力等指标得以改善，增强了心梗的治疗效果。伦敦大学的研究者也证实[12]，经尾静脉注射血浆外泌体，心梗模型大鼠的心肌梗死面积从48%降至25%，心肌功能显著改善。此外，在骨组织修复方面，给骨软骨缺损大鼠模型关节腔注射人胚胎诱导的MSCs-EXOs，12周后缺损处规则的新生透明软骨几乎完整覆盖，且再生的软骨与周围组织结合良好[13]。综上所述，外泌体能够在多种疾病模型中发挥积极的治疗作用，因此有望成为治疗组织损伤、神经系统疾病、心血管疾病、骨损伤修复等领域的新治疗方法。

3  外泌体与瘢痕抑制的研究

创伤愈合后形成的瘢痕是皮肤科及整形外科面临的棘手问题。瘢痕的本质为组织慢性纤维化，病理表现为成纤维细胞（Fibroblast，FB）激活后的异常增殖和细胞外基质（Extracelluar matrix，ECM）过度沉积[14]。近年来研究发现，外泌体中含有的生物分子可与ECM相互作用，成为细胞和细胞因子间进行信息传递的重要媒介，从而参与组织纤维化的形成与调控。已有更多的研究证实，外泌体能够参与调控心肌、肝脏、肺脏纤维化疾病进程[15-17]。也有研究表明，外泌体在创伤修复中也存在相应的调节作用，可能通过炎症反应、激活成纤维细胞、促进血管再生等途径参与损伤修复，调控纤维化进程，从而抑制瘢痕形成[1]。创伤愈合转变为瘢痕组织是一个复杂的过程，主要有炎症期、增殖期、重塑期三个阶段，已有研究表明外泌体能够在创伤修复的各阶段发挥作用，全面参与伤口愈合过程并调控瘢痕形成。

3.1 调控炎症反应：炎症期（创伤后2～3d），以损伤处白细胞大量浸润为主要特征，聚集的白细胞和肥大细胞释放组胺、酶和白三烯等活性物质，引起伤口及周围组织发生炎性反应。良好的炎性反应是机体应对有害刺激发生的防御性反应，能够为创面清除病原体及伤口的愈合形成良好的保障，但过度的炎性反应会延缓创伤修复，导致瘢痕形成。有研究表明，MSCs-EXOs参与了创面愈合的三个阶段，尤其在慢性炎症中MSCs-EXOs能够有效控制炎性反应，促使创面快速进入增殖期，以减少感染发生率[18]。MSCs-EXOs通过激活丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）传导通路，减少炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α分泌，以减轻过度的炎性反应造成的二次损伤[19]。人MSCs具有抗菌活性，能够有效降低细菌感染[20]。此外，MSCs-EXOs包裹的miRNA-let-7b，可激活STAT3/AKT及抑制TLR4/NF-κB通路，促进巨噬细胞极化，并抑制其在损伤部位的浸润，继而控制炎性反应，减少皮肤瘢痕的形成[21]。

3.2 促进细胞增殖：增殖期（创伤的第3～14天左右），此期肉芽组织增生旺盛，表现为内皮细胞和成纤维细胞增殖、迁移、分化，细胞外基质的合成沉积及新血管的生成。然而，因创面局部组织缺血缺氧导致成纤维细胞的增殖与迁移能力受损，则会使创面愈合时间延长，促进瘢痕形成。增殖环节已证明，外泌体，如：脐血MSCs-EXOs[22]、滑膜MSCs-EXOs[23]等，可通过激活蛋白激酶b（AKT）和细胞外信号调节激酶（ERK）通路，促进血管内皮细胞增殖[24]，并通过HSP70和HSP90促进成纤维细胞向伤口部位迁移及毛细血管生成，促进组织修复，减少瘢痕形成。在皮肤缺损小鼠模型中，外泌体包裹的miR-21、miR-23a、miR-125b和miR-145抑制TGF-β2/SMAD2通路，进而抑制成纤维细胞增殖，阻止了瘢痕的形成[25]。美国肯塔基大学的科学家也发现，MSCs-EXOs携带的miR-206，通过抑制成纤维细胞合成胶原所需的重要调节剂Rrbp1，可有效阻止细胞外基质过度沉积，从而抑制瘢痕形成。此外，MSCs释放血管内皮生长因子、促血管生成因子和血管生成素–1等外泌体，不仅可促进血管生成，还通过减少纤维化来改善瘢痕形成[26]。

3.3 调控胶原重塑，减少瘢痕形成：在重塑阶段，肉芽组织逐渐成熟，细胞外基质中有序交联的胶原蛋白（Collagen，COL）取代杂乱无章的胶原蛋白。de Jong等[27]报道，在2%低氧条件下，人血管内皮细胞外泌体中赖氨酰氧化酶样–2的表达可增加2倍，从而加强赖氨酸氧化酶和胶原交联活性，促进伤口愈合并改善组织纤维化。Zhao等研究发现[28]，在大鼠创面模型中，高浓度的人羊膜上皮细胞（Human amniotic epithelial cells，hAECs）hAECs-EXOs可下调细胞外基质中COL-Ⅰ、Ⅲ型的表达，调整TGF-β3/TGF-β1的比例和MMP3/TIMP1的比例[29]，促进COL-Ⅰ、Ⅲ上调及细胞外基质重建[30]。此外，MSCs-EXOs携带的miRNA，如：miR-21、miR-23a和miR-145，可通过抑制TGF来防止瘢痕形成[25]。

4  小结

外泌体来源广泛，其微小脂质双分子层囊泡内富含多种生物活性分子，在细胞间的信息交流中发挥着重要作用。外泌体包裹的蛋白质、DNA、mRNA及miRNA等活性因子，参与细胞存活与凋亡、传递免疫调节信号、调控炎症反应与组织纤维化等功能。外泌体在组织修复与再生领域中具有广阔的应用前景，可促进血管新生、优化成纤维细胞性能、调控细胞外基质沉积及胶原重塑，加速皮肤创面修复，减少瘢痕形成，因此，外泌体对复杂瘢痕的治疗具有良好的前景。

尽管目前已证明外泌体在创伤愈合及抗瘢痕的研究中具有积极效果，但仍主要停留在实验研究阶段，就其信息传递的效应成分尚不完全清楚，且当前外泌体的获取量小、纯度低，这些问题都限制了外泌体在临床中的应用。然而，随着研究技术的不断革新，利用微载体或中空纤维生物反应器等技术能够提高外泌体生产，可为其临床应用带来新希望。但在临床应用之前，希望进一步了解外泌体在促进创面修复及抗瘢痕治疗中的作用机制、生物学效应，同时提升外泌体的纯化和鉴定方法，为临床促创面愈合及防止瘢痕形成的治療开辟新路径。

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[收稿日期]2021-03-20

本文引用格式：史敏，畢芳芳，张明雨，等.外泌体在组织修复及抗瘢痕治疗中的研究进展[J].中国美容医学，2021，30（11）：179-182.