HPLC法测定袋料栽培茯苓中茯苓酸的含量

涂永勤 邢康康 陈仕江

摘要：目的 建立袋料栽培茯苓中茯苓酸的测定方法，为袋料栽培茯苓的临床应用提供依据。方法 采用HPLC测定，色谱柱：（Waters X-Bridge Shied RP C18 250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相乙腈-0.1%乙酸溶液，梯度洗脱;流速：1.0 mL/min;进样量10 μL;柱温：30℃;检测波长210nm。结果 各茯苓样品中茯苓酸的含量以野生茯苓最高为0.038%，其次是袋料栽培（室内发菌）为0.034%，树蔸栽培为0.028%、椴木栽培、袋料栽培（室外发菌）茯苓的含量在0.019～0.022之间，差异不明显。结论 该方法稳定可靠，重复性好，可以作为评价茯苓质量的方法。袋料栽培茯苓可以替代传统栽培茯苓。

关键词：茯苓;HPLC;含量测定;茯苓酸

中图分类号：R285.5   文献标志码：A   文章编号：1007-2349（2021）12-0076-03

Content of Pachymic Acid in Bag-grown Poria Cocos Determined with HPLC Method

TU Yong-qin， XING Kang-kang， CHEN Shi-jiang

（Chongqing Research Institute of Traditional Chinese Medicine， Chongqing 400065.China）

【Abstract】Objective： To establish a method for the determination of pachymic acid in bag-grown Poria cocos， and provide a basis for the clinical application of bag-grown Poria cocos. Methods： Determined by HPLC， chromatographic column was Waters X-Bridge Shied RP C18 250 mm×4.6 mm， 5 μm， and mobile phase acetonitrile-0.1% acetic acid solution， with gradient elution， 1.0 mL/min of flow rate， 10 μL of sample volume， at 30℃ of column temperature and 210nm of detection wavelength. Results： The content of pachymic acid in each Poria sample was 0.038% in wild Poria， followed by bag material cultivation （indoor fungus） at 0.034%，and  arborum material cultivation at 0.028%， and the content of linden wood cultivation and bag material cultivation （outdoor fungus） was between 0.019 and 0.022， and the difference was not obvious. Conclusion： The method is stable and reliable， with good repeatability， and can be used as a method to evaluate the quality of Poria cocos. The bag-grown Poria can replace traditional cultivation of Poria.

【Key words】Poria; HPLC; Assay; Pachymic Acid

茯苓是多孔菌科臥孔属真菌茯苓 Poria cocos（Schw.）Wolf 的干燥菌核，其菌体寄生于松木的根茎生长而成。茯苓史载于《神龙本草》，列为上品[1];为历年版《中国药典》一部所收载。茯苓具有渗湿利尿、和胃健脾、宁心安神的功效[2]。现代临床研究表明，茯苓及其配方具有抗疲劳、抗脑卒中后抑郁、治疗慢性肾小球肾炎、腹泻等疗效[3]。茯苓广泛应用于药品和食品行业，有十药九茯苓之说，为中药大品种。由于过度采挖，野生茯苓药材已十分罕见，现在临床所用药材绝大多为人工栽培。传统栽培茯苓方法是砍伐松木作为菌体繁殖材料，每年需要消耗大量的松木。松树篼栽亦可作为栽培茯苓的原料。寻找替代传统松木栽培茯苓的原料是广大科研人员的研究目标。作者开展了袋料配方栽培茯苓的研究工作，取得了成功，获得大量袋料栽培茯苓产品，有望代替传统松木栽培茯苓，以缓解砍伐松树的压力。为了确保袋料栽培茯苓的质量，本研究采用HPLC法测定袋料栽培及来自国内多个产区用传统松木栽培茯苓7个样品中茯苓酸含量，结果表明：袋料栽培茯苓中茯苓酸的含量高于传统松木栽培茯苓，为袋料栽培茯苓的临床应用提供了科学依据。

1 实验材料

1.1 实验仪器与试剂 Agilent 1200高效液相色谱仪，包括真空脱气机G1322A JP62356715;四元泵G1311A DE62959222;自动进样器G1329A DE64760202;柱温箱G1316ADE63060935;DAD检测器G1315B DE63057698及ChemStation工作站（美国Agilent公司）、Alltech ELSD 2000ES检测器（美国奥泰公司）、KQ-250DB型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）、BS223S型电子天平（万分之一）（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、Meli-Q超纯水仪（德国默克密理博有限公司）

1.2 试药与试剂 对照品：茯苓酸（批号MUST-19081510，PURITY：≥99.80%），由成都曼思特生物科技有限公司提供。

试剂：甲醇、乙腈（HPLC级）购自美国TEDIA公司，乙酸、甲醇（AR级）购自成都科隆化学品有限公司。

1.3 实验药材 茯苓药材分别采自内安徽、湖北、重庆等地，由重庆市中药研究院刘翔副研究员鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核。样本产地明细见表1。

2 实验方法

2.1 色谱条件 色谱柱：（Waters X-Bridge Shied RP C18 250 mm × 4.6 mm，5 μm）;流动相：以乙腈为流动相A，0.1%乙酸水溶液为流动相B，按表2中的规定进行梯度洗脱;流速：1.0 mL/min;柱温：30℃;进样量10 μL;DAD检测器参数：检测波长210 nm。

2.2 试验溶液的制备 对照品溶液的制备：精密称取对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.200mg茯苓酸对照品的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品粉末约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率300W，频率40kHz）30 min，放冷，再称定重量，用溶剂补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察 精密吸取2.2项下稀释的不同浓度梯度的对照品标准溶液按2.1项下色谱条件测定，平行测定3次，取平均峰面积。以进样量（X，μg）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线并进行回归计算，得到茯苓酸的回归方程。茯苓酸的回归方程：Y=5.535+E07X+156.7，R2=0.999，线性范围在0.42～42 mg/L之间。2.4 精密度试验 精密吸取2.2项下制备的茯苓样品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录茯苓酸的保留时间和相对峰面积。结果茯苓酸的相对保留时间和共有峰峰面积RSD均小于1.5%。

2.5 重复性试验 取同一批茯苓样品6份，按2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，记录茯苓酸的相对保留时间和相对峰面积。结果显示茯苓酸的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于2%。

2.6 稳定性试验 按2.2项下方法制备的同一样品溶液，室温放置，按2.1项下色谱条件分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h进样测定，记录茯苓酸的相对保留时间和相对峰面积。结果显示茯苓酸的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于1%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.7 加样回收率 精密称取已知含量的样品6份，精密称定并加入一定量茯苓酸对照品，按2.2项下方法制备样品，加样回收率按如下公式计算：回收率（%）=（测得量-已知样品中量）/加入量×100。结果显示上述茯苓酸的平均加样回收率均高于95%，其RSD均小于2%。

2.8 样品测定 不同产地的样品，按2.2项下方法制备样品溶液，按2.1项下色谱条件测定，结果如表3。

3 讨论

本实验经过筛选确定色谱条件：色谱柱：Waters X-Bridge Shied RP C18 250 mm×4.6 mm，5 μm;流动相：乙腈-0.1%乙酸溶液，梯度洗脱;流速：1.0 mL/min;进样量10 μL;柱温：30℃;DAD检测器;检测波长210nm。具有较好分离效果。

茯苓酸是茯苓中特有的一种四环三萜化合物，是茯苓的主要活性成分之一。茯苓酸具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、镇静催眠等方面的药理作用[3]。含量測定结果表明不同栽培方式对茯苓酸有显著影响。各茯苓样品中茯苓酸的含量以野生茯苓最高为0.038%，其次是袋料栽培（室内发菌）茯苓0.034%，树蔸栽培茯苓为0.028%，椴木栽培、袋料栽培（室外发菌）茯苓的含量为0.019-0.022%之间，差异不明显。袋料栽培茯苓室内发菌>室外发菌，可能由于室内温度较高，有利于茯苓酸的合成或积累。因此，袋料栽培（室内发菌）茯苓的质量优于传统椴木栽培茯苓，从而为袋料栽培茯苓的应用前景提供科学依据。

参考文献：

[1]罗大伦.《神农本草经》里的中药智慧茯苓[J].食品与健康，2012，9（3）：36-37.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京 中国医药科技出版社，2015：240.

[3]张晓娟，左冬冬，范越.茯苓化学成分、质量控制和药理作用研究进展 中医药信息 2014，31（1）：117-119.

[4]赵英博，徐 斌，昝俊峰，等 不同产地茯苓中茯苓酸含量的比较研究[J].中国中医药信息杂志，2009，16（7）：41-42.

[5]徐 斌，昝俊峰，何丽姗，等.27种菌种茯苓中茯苓酸分析比较研究[J].中草药，2010，41（4）：647-649.

[6]段 启，姚丽梅.茯苓与茯苓皮中茯苓酸含量比较研究[J].中药新药与临床药理，2010，21（6）：654-655.

（收稿日期：2021-07-19）