改良激光辅助孵化技术在解冻移植（FET）周期中的应用

江旺航 吴成亮 苏占营 辜敏

[摘要] 目的 探討改良激光辅助孵化技术（LAH）对冻融胚胎（D3、D5、D6）临床结局的影响。 方法 回顾性分析2019年1月至2020年12月在本生殖中心实施玻璃化冻融胚胎移植的患者共计786例，其中进行改良激光辅助孵化LAH 338例，传统激光辅助孵化（LAH）448例。观察两组受精胚胎的复苏率、胚胎植入率、临床妊娠率、早期流产率、异位妊娠率等临床指标。 结果 两组胚胎复苏率、胚胎植入率、临床妊娠率、早期流产率、异位妊娠率分别为100.00%和99.32%、49.35%和42.34%、62.43%和57.81%、9.48%和17.76%、1.42%和2.70%;改良LAH组的胚胎植入率、临床妊娠率、早期流产率、异位妊娠率和传统LAH组相比较，差异有统计学意义（P<0.05），胚胎复苏率比较，差异无统计学意义（P>0.05）;改良LAH组中的囊胚（D5、D6）组临床妊娠率、胚胎植入率与D3胚胎组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;囊胚（D5、D6）早期流产率、异位妊娠率与D3胚胎组相比较，差异有统计学意义（P<0.05）;两组的胚胎复苏率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 改良激光辅助孵化技术比传统激光辅助孵化技术对冻融胚胎（D3、D5、D6）在临床结局上有一定的优化作用。

[关键词] 改良激光镭射;辅助孵化;冻融胚胎;临床结局

[中图分类号] R714.8          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2021）28-0083-05

Application of modified laser-assisted hatching technique in frozen-thawed embryo transfer （FET） cycle

JIANG Wanghang   WU Chengliang   SU Zhanying   GU Min

Department of Assisted Reproduction， Maternal and Child Health Hospital of Jiujiang City， Childrens' Hospital of Jiujiang City in Jiangxi Province， Jiujiang  332000， China

[Abstract] Objective To explore the impact of modified laser-assisted hatching （LAH） technique on the clinical outcome of frozen-thawed embryos （D3， D5， D6）. Methods A total of 786 patients who underwent vitrification freeze-thaw embryo transfer in our reproductive center from January 2019 to December 2020 were retrospectively analyzed， including 338 cases of modified LAH and 448 cases of traditional LAH. The clinical indicators such as resuscitation rate， embryo implantation rate， clinical pregnancy rate， early miscarriage rate， and ectopic pregnancy rate of the fertilized embryos in the two groups were observed. Results The embryo resuscitation rates， embryo implantation rates， clinical pregnancy rates， early miscarriage rates， and ectopic pregnancy rates in the two groups were respectively 100.00% and 99.32%， 49.35% and 42.34%， 62.43% and 57.81%， 9.48% and 17.76%， 1.42% and 2.70%. The embryo implantation rates， clinical pregnancy rates， early miscarriage rates， and ectopic pregnancy rates in the modified LAH group showed differences with statistical significance （P<0.05） than the traditional LAH group， and there was no significant difference in the rates of embryo resuscitation（P>0.05）. The clinical pregnancy rates and embryo implantation rates of the blastocyst （D5， D6） group in the modified LAH group had statistically significant differences （P<0.05） than the D3 embryo group. The early miscarriage rates and ectopic pregnancy rates of the blastocyst （D5， D6） showed differences with statistical significance （P<0.05） than the D3 embryo group. The difference in embryo resuscitation rates between these two groups was not significant， without statistical significance （P>0.05）. Conclusion The improved laser-assisted incubation （LAH） technique was better than the traditional laser-assisted incubation technique in optimizing the clinical outcome of freeze-thaw embryos （D3， D5， D6）.

[Key words] Modified laser; Assisted hatching; Frozen-thawed embryo; Clinical outcome

透明带是一种包裹在人类卵母细胞和早期胚胎周围的由糖蛋白、碳水化合物和透明带特种蛋白构成13～15 μm厚非细胞结构。透明带有两层的，外层稍厚，内层薄而有弹性。透明带在着床前参与精子顶体反应并促进精子卵子融合，防止多精子受精以维护早期胚胎的三维结构，形成保护屏障。人类在内的大多数哺乳动物胚胎，发育至囊胚阶段后，透明带因囊胚腔扩张逐渐变薄，这一过程叫自然孵化。囊胚先从透明带中释放再进入宫腔，以使滋养外胚层细胞与子宫内膜细胞接触，从而着床。胚胎和子宫共同作用使透明带在宫腔中消失。一些学者可以观察到哺乳动物囊胚孵化前的扩张和透明带变薄及人类囊胚的体外培养中，孵化阶段透明带还会发生周期性的收缩和膨胀，这样使囊胚扩张和透明带糖蛋白的张力形成，经过多次周期性的收缩膨胀，透明带厚度逐渐变薄，直至破裂。滋养层细胞从透明带破裂口延伸突出，最终整个囊胚孵出于透明带外，胚胎定位，着床、植入于子宫内膜。胚胎先要能顺利孵出，才能在子宫内膜上着床。胚胎在体外培养过程中可能会缺少细胞溶解素等物质，从而导致透明带变硬，滋养层细胞可以分泌溶解素，使透明带可以变软容易破口。Sehiewe等[1]证实过胚胎在体外培养环境中，溶解素的数量会减少，而且质量会变差，从而会导致囊胚很难从透明袋中孵出，从而无法在内膜上着床。Manna等[2]通过评估透明带消失的时间，也证实胚胎在体外培养透明带会硬化从而阻碍胚胎孵出或延长囊胚扩张时间，缺少子宫分泌的溶解透明带物质，也可导致胚胎很难孵出。在体外授精（IVF）过程中，随着女性年龄增加、卵泡刺激素（FSH）水平升高都可以导致胚胎透明带加厚或者畸形，也会使胚胎在子宫环境下孵出困难。Wood[3]认为胚胎在冷冻过程中容易受到损伤进而可能会减弱其着床的能力;而且冷冻复苏过程也增加了透明带在囊胚孵出过程中的阻力，使囊胚很难孵出，采用辅助孵化（Assisted hatching，AH）可优化早期卵裂胚胎和囊胚[4]的扩张和孵出，从而提高其临床的各项指标。

辅助孵化激光法（Laserassisted hatching，LAH）是各种辅助孵化技术[5]中的一种，相对于其他辅助孵化技术更简便、快速、安全[6]，目前大多数生殖中心采用LAH将新鲜胚胎和冻融胚胎的透明带进行削薄或开口化处理，以望改善其移植后的临床结局[7]。我中心将传统的LAH进行改良，经过改良激光辅助孵化技术在进行孵化时，处理的范围更大，更符合胚胎着床的生理过程，同时切除透明带的部位更大（<1/4），不会在孵出中产生嵌顿，而且选择在解冻第二步（细胞仍处于皱缩期）开始激光孵化，不直接接触透明带内的细胞，可以最大程度上避免对细胞的热损伤，接触透明带的位置、切除厚度、作用时间等均优于薄化和打小孔。本研究将改良激光辅助孵化技术运用于解冻移植周期中，使冻融胚胎的胚胎植入率和临床妊娠率提高并且降低异位妊娠率、流产率，对促进试管婴儿成功率的提高具有一定的临床意义[8]，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年1月至2020年12月在我院生殖医学中心施行解冻移植周期的患者作为研究对象（共786个周期），纳入标准[9]：①年龄<40岁;②施行IVF-ET技术的周期，胚胎发育为D3、D5、D6[10]三期的胚胎;③D5、D6囊胚优胚率（4BB级别以上包括4BB）和D3优胚率（卵裂球数≥7个，碎片率<25%）标准不一样，三期胚胎优胚率均达到85%以上。排除标准[11-16]：①染色体异常者;②生殖系统畸形者;③输卵管积水者;④子宫内膜薄者;⑤子宫内膜异位症者;⑥5期和6期冷冻囊胚者;⑦因胚胎的优劣而影响临床结局者。根据患者知情同意后进行改良激光辅助孵化技术分为改良LAH组338个周期和传统LAH组448个周期。

1.2 方法

1.2.1 促排卵和IVF-ET  采用常规方法进行促排卵、取卵、体外受精和胚胎培养，采用的试剂为瑞典Vitrolife系的G1和G2。胚胎质量评估内容有卵裂球的数目、碎片百分比、大小均匀度及发育速度。D3期移植1～2枚胚胎，移植后剩余的胚胎再经过患者知情同意后，将其冷冻保存或继续培养成D5/D6期的囊胚再冷冻保存起来。将自然周期或激素替代周期作为FET子宫内膜的准备方案，囊胚评分采用Gardner评分标准，其详细内容如下[17]。根据囊胚腔的大小和是否孵化将囊胚的发育分为6个时期：1期：早期有腔室囊胚，囊胚腔小于胚胎总体积的1/2;2期：囊胚腔体积≥胚胎总体积的1/2;3期：完全扩张囊胚，囊胚腔完全占据了胚胎的总体积;4期：扩张囊胚，囊胚腔完全充满胚胎，胚胎总体积变大，透明带变薄;5期：正在孵出的囊胚，囊胚的一部分从透明带中逸出;6期：孵出的囊胚，囊胚全部从透明带中逸出。处于3～6期的囊胚内细胞团质量分级：A级：细胞数目多，排列紧密;B级：细胞数目少，排列松散;C级：细胞数目很少。3～6期的囊胚滋养层细胞分级：A级：上皮细胞层由较多的细胞组成，结构致密;B级：上皮细胞层由不多的细胞组成，结构松散;C级：上皮细胞层由稀疏的细胞组成。

1.2.2 两组激光破膜设备和参数  本中心采用激光破膜仪为Research instrument（Saturn Active），激光功率为300 mW，脉冲寬度为0.001～2.000 ms。在高倍显微镜下寻找胚胎，再切换激光物镜下，电脑鼠标控制位置，科学调整激光发射时间。传统激光辅助孵化在透明带打孔薄化和打孔，激光半径为3.8 μm，脉冲宽度为 0.158 ms;改良激光辅助孵化主要是消除<1/4透明带（包含冷冻前激光皱缩时透明带开孔处），激光半径为 9.7 μm，脉冲宽度为0.405 ms。

1.2.3 玻璃化冷冻和试剂  囊胚在冷冻前要进行激光法，人工在透明带打孔皱缩，等到囊腔快完全皱缩后再冷冻。采用的试剂为日本加藤VT101玻璃化冷冻试剂盒，在室温25℃左右先将胚胎转移至平衡（ES）液，卵裂球和囊胚分别在ES液中的平衡时间为5～6 min和7～8 min。再将胚胎转移至玻璃化（VS）液，在60 s内将胚胎装载到日本加藤Cryotop冷冻载杆上，最后投入液氮中保存。

1.2.4 玻璃化冷冻胚胎的解冻和试剂  解冻采用的试剂是日本加藤VT102玻璃化解冻试剂盒，将装载有冻胎的载杆放入事先在37℃预温的解冻液WS1中停留1 min，转入WS2液中停留3 min，再依次转移胚胎至解冻液WS3、WS4液各停留5 min，最后将胚胎转入已经平衡好的囊胚培养液G2（Vitrolife系列，瑞典）中。胚胎复苏的标准为解冻后胚胎复苏的细胞数≥50%总细胞数。

1.2.5 传统激光辅助孵化及胚胎移植和试剂  卵裂期胚胎在解冻复苏完成转入囊胚培养液G2（Vitrolife系列，瑞典）皿后，进行激光法人工在透明带打孔薄化和打孔，囊胚在冷冻前要进行激光法人工在透明带打孔皱缩，复苏后不进行激光处理。孵化后用含10%人血清蛋白的囊胚培养液G2（Vitrolife系列，瑞典）洗涤数次，移入囊胚培养液，待培养2～3 h后再移植。移植胚胎后给予黄体支持，移植后14 d查验血HCG，移植后28 d B超检查见孕囊为临床妊娠。

1.2.6 改良激光镭射辅助孵化及胚胎移植和试剂  卵裂期胚胎、5期以下囊胚在解冻第二步（此时囊胚未完全扩张）立即行改良激光辅助孵化技术，在相对较大或碎片较多的卵周间隙区域，采用非接触式的激光显微操作系统RI（Saturn Active），调整其激光靶心定位于该处的透明带，点击激光切换成连续发射键模式，连续发射激光削除<1/4透明带（包含冷冻前激光皱缩时透明带开孔处），保证中心部位完全穿破透明带。整个辅助孵化过程在30 s内完成。孵化后用含10%人血清蛋白的囊胚培养液G2（Vitrolife系列，瑞典）洗涤数次，移入囊胚培养液，待培养2～3 h后再移植。移植胚胎后给予黄体支持，移植后14 d查验血HCG，移植后28 d B超检查见孕囊为临床妊娠。

1.3观察指标及评价标准

胚胎移植14 d后进行HCG检测，移植后28 d行B超监测，观察到孕囊为临床妊娠。12周前发生的胚胎停育为早期流产，统计中观察到胎心搏动孕囊数目即种植胚胎数目同移植胚胎数目的比例为胚胎种植率;临床妊娠患者数目同进行胚胎移植患者数目的比例为临床妊娠率;早期流产数目同妊娠患者数目比例为早期流产率。异位妊娠是指孕囊着床位置于子宫体腔外，其中包括宫外妊娠和宫内外同时妊娠。主要观察这些胚胎复苏率、胚胎植入率、临床妊娠率、异位妊娠率、早期流产率等临床指标。复苏（胚胎存活）率=复苏胚胎存活数/复苏胚胎总数×100%。临床妊娠率=冻融临床妊娠周期数/冻融移植周期数×100%。胚胎植入率（着床率）=孕囊数/冻融总移植周期数×100%。早期流产率=孕12周内自然流产周期数/冻融临床妊娠周期数×100%。异位妊娠率=异位妊娠周期数/冻融临床妊娠周期数×100%。

1.4统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验;计数资料以[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组临床结局比较

通过比较改良LAH组338例和传统LAH组448例的周期结果，再对周期结果统计分析发现，两组年龄、不孕年限、不孕类型、内膜厚度、移植胚胎数、胚胎复苏率比较，差异无统计学意义（P>0.05），改良LAH组在临床妊娠率、胚胎植入率上数值均高于传统LAH组（57.81%，42.34%），且早期流产率、异位妊娠率要低于传统LAH组（17.76%，2.70%），两组胚胎植入率、临床妊娠率、异位妊娠率、早期流产率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2改良LAH组中D3、D5、D6的各项临床指标比较

改良LAH组中D3，D5，D6的年龄、不孕年限、不孕类型、内膜厚度、移植胚胎数、胚胎优胚率，胚胎复苏率比较，差异无统计学意义（P>0.05），改良LAH组中的囊胚（D5、D6）组临床妊娠率、胚胎植入率与D3胚胎组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;囊胚（D5、D6）组的异位妊娠率、流产率与D3胚胎组的比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3讨论

AH是在20世纪90年代得到应用。激光辅助孵化具有定位准确、操作时间短、胚胎暴露于体外时间短、可重复使用、无须昂贵的操作仪器等优势，可有效降低辅助生殖周期成本，与其他孵化方式相比，是一个相对安全、有效的选择。理论上将AH应用于解冻移植（FET）可以提高FET中冻融胚胎的临床效果[18]。冯清等[19]首先在卵裂胚胎上采用AH技术，从而展开AH的临床实践研究。也有学者经研究表明，采用AH技术显著提高临床妊娠率[20]。还有研究表明，冻融复苏周期、高龄、高FSH、胚胎透明带异常是AH的常见适应证[21-23]。虽然传统LAH有以上诸多优点但传统LAH有以下缺点：一传統LAH开孔过大，卵裂球容易跑出透明带，开孔过小容易发生卵裂球嵌顿;二激光光束过大，且激光时机不当，易损伤卵裂球。这两点也会影响着床率、临床妊娠率、异位妊娠率、早期流产率。改良LAH在透明带上开孔的大小通常是30～40 μm，而且选择在解冻第二步（细胞仍处于皱缩期）开始激光孵化，不直接接触透明带内的细胞，可以最大程度上避免对细胞的热损伤[24]。

本研究中，两组数据按激光打孔方式和时机不同分为传统激光辅助孵化和改良激光辅助孵化两组，两组年龄，不孕年限，不孕类型，内膜厚度，移植胚胎，胚胎复苏率等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），说明两组的一般资料一致。而且研究中的冷冻解冻胚胎都是有两名熟练掌握人类胚胎冷冻解冻临床操作技术的胚胎师随机完成的。操作人员对标准化操作规程和试剂使用、载杆使用熟练并严格执行，尽量消除研究过程中的由操作人员引起的试验误差。本研究结果显示，改良LAH组在临床妊娠率、胚胎植入率上数值均高于传统LAH组（57.81%，42.34%），且早期流产率、异位妊娠率要低于传统LAH组（17.76%，2.70%），两组胚胎植入率、临床妊娠率、异位妊娠率、早期流产率比较，差异有统计学意义（P<0.05），可能是改良LAH的热损伤小，不易发生卵裂球嵌顿，从改良激光辅助孵化技术看要优于传统激光辅助孵化技术，从而胚胎植入率高，临床妊娠率也高，透明带打孔直接将胚胎暴露于子宫环境，人为地干扰了胚胎的内环境，内膜和胚胎的分子交互可能会影响胚胎着床，改良LAH组在临床妊娠率、胚胎植入率上数值均不同程度高于传统LAH组，且流产率、异位妊娠率要低于传统LAH组。

胚胎发育至囊胚阶段后透明带已经比卵裂胚更薄。故两种激光辅助孵化方式对囊胚都能有效减少冷冻过程中透明带变硬带来的阻力。这两种激光孵化方式的作用效果可能被囊胚的高着床率和高妊娠率的特点掩盖而无明显差异。如果后续再统计传统激光辅助孵化的D3，D5，D6分组，可能还会得知主要差距是在D3这组里。本研究显示，改良LAH组D3，D5，D6在年龄、不孕年限、不孕类型、内膜厚度、移植胚胎数、胚胎复苏率上比较，差异无统计学意义（P>0.05），其中改良LAH组中的D3临床妊娠率和胚胎植入率均低于D5和D6的，且异位妊娠率和早期流产率都偏高于D5和D6的。

本研究也有局限性：一作为回顾性研究，在患者选择上有一定随机性，二两组时间跨度比较大，样本量相差也比较大，三部分患者还在待孕状态，无法统计总流产率和活产率，在后期追踪活产率等临床数据，再进行两组中的D3、D5、D6分别比较。

综上所述，改良LAH组在临床结局上要优于传统LAH组，并且在改良LAH组中，D5和D6胚胎的临床结局均优于D3胚胎的临床结局。

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（收稿日期：2021-04-07）