干旱胁迫下枯草芽孢杆菌对玉米种子抗旱性及生理指标的影响

李 安 舒健虹 刘晓霞 蒙正兵 王小利 赵德刚

（1贵州大学生命科学学院（农业生物工程研究院）/山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室/山地生态与农业生物工程协同创新中心，550025，贵州贵阳；2贵州省农业科学院草业研究所，550006，贵州贵阳）

玉米是我国重要的粮饲作物，可作为工业原料、食品和牲畜饲料，在粮饲生产和农业产业结构方面发挥着重要作用，所以玉米产量影响着国家粮食安全。玉米对水分敏感，水分已成为制约玉米产量的重要生态因子，而对于多数作物而言，干旱胁迫反应敏感的关键时期都是芽苗期[1]，干旱胁迫下往往能造成作物种子幼苗的根系、叶片等形态学特征发生变化，出现叶面积减小、植株变矮的现象，从而使玉米生长不足、产量低[2]，所以提高玉米抗逆性是提高产量的有效方式。研究表明，依赖植物的根际促生菌（PGPR）可以增强作物的抗逆性，王孝先等[3]对砂生槐根际促生菌的筛选及干旱胁迫对其种子萌发和幼苗生长的研究表明，接种菌株的促生效果优良，同时又增强了种子抗旱性。枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）属PGPR，其生理特征丰富多样，极易分离培养，能产生多种抗菌素和酶，可用来研究PGPR与植物的共生关系。枯草芽孢杆菌应用于植物病害生物防治的研究已经有多年历史，目前在黄瓜[4-5]、辣椒[6-7]、水稻[8-9]、小麦[10-12]和玉米[13-15]等作物病害上表现出较好的防治效果[15]。近年来，科学家们从枯草芽孢杆菌产生拮抗物质的类型、分子作用机理及田间应用等方面开展了广泛而深入的研究，为进一步明确枯草芽孢杆菌的作用机制和作用效果提供了科学依据。枯草芽孢杆菌产生的细胞素对霉菌和酵母细菌有一定的抑制作用；其产生的酶类可以消解病原菌的细胞壁；以及活性蛋白质能够溶解细胞壁，造成菌丝畸形，孢子不发芽或者异常[15]。与此同时，枯草芽孢杆菌能产生生长激素，如生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯等，促进植物生长，继而改善农作物生长发育[16-17]。利用植物激素是调控植物抗旱能力的手段之一[18]。因此，研究干旱胁迫下枯草芽孢杆菌菌种对玉米萌发的生理调节作用对于生物菌肥的开发具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试玉米种子为金玉818，由贵州省农业科学院旱粮研究所提供，枯草芽孢杆菌菌种为贵州省野外采集实验室保存（表1）。

表1 试验菌种来源及编号Table 1 Source and number of tested bacteria

1.2 试验方法

1.2.1 菌种制备 将 4个菌种培养扩增，调节OD600值至0.9左右，离心，取沉淀用于菌种试验。

1.2.2 种子预处理 将玉米种子用10%次氯酸钠溶液消毒20min，再用无菌水洗涤3～5遍，自然晾干后备用。

1.2.3 试验处理 设置10个处理，分别为20mL无菌水+菌种（编号A1、B1、C1、D1）、20mL 15%PEG+菌种（编号A2、B2、C2、D2）以及20mL无菌水（CK1）和20mL 15% PEG（CK2）。准备铺有2张滤纸的灭菌培养皿，取45粒外观均匀良好的玉米种子置于上述培养皿中。每个处理 3次重复，从处理时间起，每日记录发芽数，直至不再发芽为止。

1.3 测定指标及方法

自播种起每日记录发芽数以及发霉数，发芽结束后，测定根长、根数、幼苗鲜重、根鲜重、芽鲜重、总生物量、根冠比等发芽指标，然后放置于烘箱 105℃烘 24h，称量芽与根干重。测定相对含水量、发芽指数及活力指数，同时测定芽叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性以及丙二醛（MDA）和叶片游离脯氨酸（Pro）含量。

计算公式：发芽率（GR）=7d内发芽种子数/供试种子总数；发芽势（GP）=3d内发芽种子数/供试种子总数；发芽指数（GI）=Σ(Gt/Dt)，Gt为第t天发芽数，Dt为发芽天数；活力指数（VI）=GI×SL；SL 为幼苗鲜重；幼苗含水量（%）=（SL-G）/SL×100，G为幼苗干重；

采用SOD抑制氮蓝四唑（NBT）光化还原法[19]测定 SOD活性；采用紫外吸收法[20]测定 CAT活性；采用磺基水杨酸法[21]测定Pro含量；采用硫代巴比妥酸法[22]测定MDA含量；采用愈创木酚法[23]测定POD活性。

1.4 数据处理

采用Excel 2016和SPSS软件进行数据统计分析，利用下列公式计算隶属函数值、抗旱性量度值和加权抗旱指数。

隶属函数值：

标准差系数：

权重系数：

抗旱指数：

抗旱性量度值：

式中，Xij和Xj分别表示第i处理第j个指标的隶属值和所有株系第j个指标的平均值；Xmin和Xmax分别表示第j个指标的最小值和最大值；m与n分别表示指标的个数和处理数。耐旱系数（PI）=不同处理下测定平均值/对照测定值；计算隶属函数值时，指标与耐旱性呈正相关时使用公式(1)，指标与耐旱性呈负相关时用公式(2)。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下不同菌种处理对玉米种子萌发及幼苗含水量的影响

由表1可知，除B1外，正常无干旱胁迫下，各菌液处理下发芽率均显著高于CK1，B1处理下种子发芽指数以及A1活力指数显著低于CK1，其余发芽指标均与CK1差异不显著。干旱胁迫下，各菌液处理发芽势均显著高于CK2，除B2处理，其余各处理发芽率均显著高于CK2，A2发芽指数显著高于CK2。在活力指数方面，D2活力指数显著（P＜0.05）高于其他处理，其余各处理间差异不显著，各处理幼苗含水量差异不显著。干旱处理萌发指标较正常情况有不同程度降低。

2.2 干旱胁迫下不同菌种处理对玉米发芽指标的影响

由表3可知，与CK1相比，B1、C1和D1处理下的芽长、根长、根数、总生物量干重、芽干重和芽鲜重等生长指标显著提高，根冠比显著降低，根干重差异不显著；B1、C1处理下，根鲜重显著高于CK1，A1处理根干重和根冠比显著低于CK1。干旱胁迫下，D2处理下玉米根长、总生物量干重、芽干重与根鲜重均显著高于CK2，A2、B2和C2处理的根长与CK2之间差异不显著。B2、C2和D2处理的芽长、根数、根干重与根冠比等萌发期生长指标与CK2差异不显著，而A2处理下芽长显著低于CK2。整体来说，不同枯草芽孢杆菌处理对玉米萌发期相关指标存在不同的影响，其中D2处理有更强的优势。

表2 不同处理对玉米种子萌发及幼苗含水量的影响Table 2 Effects of different treatments on seeds germination and seedling water contents of maize

表3 不同处理对玉米生长相关指标影响Table 3 Effects of different treatments on corn related growth indexes

2.3 干旱胁迫下隶属函数值和标准差系数赋予权重法分析

不同菌种处理下，运用模糊数学隶属函数公式对玉米种子萌发过程中的抗旱性各指标进行标准化处理，并且利用标准差系数赋予权重法对各指标赋予权重，从而定量地比较株系间的抗旱能力。由表4可知，各菌种处理下玉米萌发过程抗旱性为D2＞B2＞C2＞A2＞CK2。进一步对D值和各发芽指标进行相关性分析，结果（表5）显示，D值与玉米萌发活力指数、根长、幼苗含水量等指标呈显著的正相关关系，除根干重与根冠比外与其他指标呈正相关关系。由此，D值既考虑各指标的重要性，又考虑了各指标间的相互关系，因此，用D值综合评价抗旱性较为全面和准确。

表4 干旱胁迫下玉米萌发抗旱综合评价Table 4 Comprehensive evaluation of maize germination drought resistance under drought stress

表5 干旱胁迫下玉米萌发指标相关性分析Table 5 Correlation analysis of maize germination indexes under drought stress

2.4 干旱胁迫下不同菌种处理对玉米萌发过程中SOD、CAT和POD活性的影响

由图1所示，与非干旱胁迫相比，干旱胁迫下玉米萌发过程中的抗氧化酶SOD、CAT和POD的活性都呈现出增加的趋势，而干旱胁迫与非干旱胁迫接种枯草芽孢杆菌菌体显著降低了SOD、CAT和POD的活性。值得注意的是，干旱胁迫与非干旱胁迫接种菌剂对于POD活性的影响较小，其中B与D干旱胁迫处理下显著降低了POD活性，而接种菌剂处理下，SOD和CAT活性都呈现出显著降低的趋势。这表明干旱胁迫下玉米抗氧化酶SOD、CAT和POD活性都得到提高以应对干旱对植物的损伤，接种菌剂降低了干旱胁迫对酶活性的影响。

图1 不同菌种处理对玉米萌发过程中SOD、CAT及POD活性的影响Fig.1 Effects of different strains treatments on the activities of SOD, CAT and POD during corn germination

2.5 干旱胁迫下不同菌种处理对玉米萌发过程中渗透物质Pro含量的调节

干旱胁迫与非胁迫下及不同菌种处理对玉米萌发过程中渗透物质Pro含量的调节存在差异。由图2a所示，干旱胁迫下，玉米萌发过程中芽尖 Pro含量明显提高以增加细胞内渗透物质含量，防止细胞内水分子的流失。其中接种枯草芽孢杆菌 D的玉米芽尖 Pro含量显著高于对照组与其余各枯草芽孢杆菌处理，而在非胁迫下除接种枯草芽孢杆菌A以外，其余各菌株均能提高玉米芽尖的Pro含量。

2.6 干旱胁迫下不同菌种处理对玉米萌发过程中MDA含量的调节

如图2b所示，干旱胁迫与非胁迫下不同菌种处理对玉米萌发过程中渗透物质Pro和芽尖MDA含量的调节趋势并不一致，在非干旱胁迫下，接种枯草芽孢杆菌的A1、B1和C1处理显著高于对照组玉米芽尖的MDA含量。值得注意的是，接种枯草芽孢杆菌D显著提高了玉米芽尖的Pro含量，但玉米芽尖的MDA含量与对照组差异并不显著，且低于接种A、B和C菌种。在干旱胁迫下，对照组MDA含量显著高于接种枯草芽孢杆菌的处理，其中接种D菌种的处理显著低于其余各处理。整体而言，干旱胁迫下接种枯草芽孢杆菌降低了玉米芽尖的MDA含量，其中接种枯草芽孢杆菌D的下降幅度最大。

图2 不同菌种处理对玉米萌发过程中渗透物质Pro与MDA含量的影响Fig.2 The effects of different strain treatments on the contents of osmotic substance Pro and MDA during corn germination period

3 讨论

发芽率、发芽势和种子活力指数反映植物种子发芽速度、发芽整齐度和幼苗健壮的趋势，常作为评价种子发芽的指标[24]。本研究表明，接种枯草芽孢杆菌能够提高玉米发芽率及发芽势，不同菌种处理具有一定差异。C菌种处理能够提高玉米种子的发芽指数与活力指数；干旱胁迫下接种枯草芽孢杆菌A有利于提高玉米种子发芽指数，而接种枯草芽孢杆菌D有利于提高其活力指数。根系是植物吸收水分的最主要的器官，对外界环境水分的变化反应极为敏感，水分胁迫下根系形态会发生变化。本试验中测定干旱胁迫与非胁迫下接种不同的枯草芽孢杆菌玉米萌发期的根长、芽长、根鲜重、芽鲜重、根干重和芽干重等发芽指标，并对玉米各项发芽指标进行干旱胁迫下隶属函数和标准差系数赋予权重法分析，将不同的发芽指标进行综合运算，通过其结果加权抗旱指数、隶属函数均值、D值，从而综合评价干旱胁迫与非胁迫下接种不同枯草芽孢杆菌菌种对玉米萌发的影响。此方法在魏波等[25]进行的 PEG模拟干旱条件下红花种子萌发特性的比较研究中用到。D值是对各个玉米发芽指标的综合评价，并通过D值与玉米各项指标之间的相关性分析，发现D值与玉米萌发活力指数、根长、根数等指标呈显著正相关关系，与其他指标呈正相关关系。而根据加权抗旱指数、隶属函数均值和D值的综合评价结果可知，干旱胁迫下，各菌种处理玉米萌发过程抗旱性为D2＞B2＞C2＞A2＞CK2，干旱胁迫环境下接种枯草芽孢杆菌提高了玉米种子萌发过程中的抗逆性。

干旱胁迫下，植物会因缺水而受到伤害，甚至死亡。为了适应或抵抗缺水的不利环境，植物形成了从表型特征变化、生理生化响应等应激方式来维持自身的水分状况，以避免或减轻缺水对植物的伤害[26]。从形态上具体表现为植株矮化、叶片角质层增厚、气孔下陷、气孔关闭、根系更为发达、根冠比增高、蒸腾面积减小；植物通过表型特征变化有效增加水分吸收量，同时降低水分散失；生理生化响应机制可分为2类，一是通过积累可溶性糖、可溶性蛋白、Pro等渗透物质调节细胞内渗透压，防止水分子的损失，同时能量消耗也降低，使植物抗逆性增强，这是植物适应干旱胁迫的重要方式[27-29]。本研究中干旱与非干旱胁迫下接种不同枯草芽孢杆菌玉米萌发过程中Pro的积累结果显示，接种枯草芽孢杆菌在干旱与非干旱胁迫下都提升了Pro的含量，且干旱胁迫下接种不同的枯草芽孢杆菌玉米萌发过程中Pro的积累情况与抗旱评价相印证，即D2＞B2＞C2＞CK2；二是干旱胁迫下，植物抗逆性增强同时还表现在植物非酶促反应与酶促反应方面。酶促反应系统主要为SOD、POD和CAT等一系列复杂的过程与酶调控植物体内活性氧代谢维持着动态平衡[30-31]。作为系统性的调节，单一的抗氧化酶或抗氧化物并不足以防御活性氧胁迫对植物的伤害，它们需要协同作用以共同抵抗干旱胁迫引起的氧化伤害。在干旱胁迫下，抗旱性强的植物体内SOD、POD和CAT的活性一般较高，因而能够有效清除植物体内活性氧，抑制膜脂过氧化，缓解植物因干旱胁迫受到的伤害。虽然发现干旱胁迫与抗氧化酶活性之间存在显著的相互作用，但PGPR菌株处理往往会降低干旱胁迫对酶活性的影响[32]。在枯草芽孢杆菌处理下，玉米种子SOD、POD和CAT等抗氧化酶的活性降低。干旱与非干旱胁迫下接种不同的枯草芽孢杆菌的玉米芽尖 SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性变化一致。

通过测定 MDA含量可判断植物细胞受胁迫损伤程度，MDA是膜脂过氧化的主要降解产物，可导致细胞结构的破坏以及功能的丧失。干旱条件下，MDA含量会随着胁迫程度加重而增加是判断植物抗旱性的重要指标[33-34]。本试验在干旱与非干旱胁迫下接种不同的枯草芽孢杆菌，通过测定玉米芽尖的MDA含量，发现接种枯草芽孢杆菌的玉米在非胁迫下与对照组差异较小，且各处理间差异也较小。但是干旱胁迫下接种枯草芽孢杆菌使玉米芽尖MDA含量有显著性的降低，其中接种枯草芽孢杆菌D的玉米芽尖MDA含量最低，体现出接种枯草芽孢杆菌能够提高玉米在干旱胁迫下的抗逆性。

4 结论

各菌种处理下玉米萌发过程抗旱性表现为R60＞R9-1＞R59＞R29-1＞CK2。接种枯草芽孢杆菌能提升玉米萌发过程的Pro含量，降低抗氧化酶SOD、CAT和POD活性，同时能够有效减轻细胞膜受到的伤害，尤其接种枯草芽孢杆菌 R60效果更加显著。选择何种菌种进行微生物菌肥的生产需要对玉米生长各生育时期进行研究，从而优选出更利于玉米产量增加的菌种。