紫花苜蓿氮效率及其类型特征研究

刘晓静，赵雅姣，郝凤，童长春

（甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃省草业工程实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃兰州730070）

作物的氮效率表现为作物对氮素的响应，主要表现在作物对氮素吸收效率和利用效率上的差异，进而表现出不同的生长及营养状况［1］。自1939 年Harvey［2］首次发现玉米（Zea mays）的不同品种在氮素吸收方面存在差异以来，有关植物品种间氮效率差异引起了研究者的广泛关注，大量研究工作就此展开。目前，在对小麦（Triticum aestivum）［3］、水稻（Oryza sativa）［4］、玉米［5］和油菜（Brassica napus）［6］的研究中均证实同一种作物的不同品种在氮效率方面存在差异，主要表现为不同品种在不同氮素水平下对氮素的吸收和利用等方面的差异，同时，施用不同氮肥后其生长及生理特性也不尽相同。因此，在不同供氮水平下筛选具有产量增长潜力的氮高效品种以及发掘作物氮高效潜力，是提高氮肥利用效率，减少氮肥损失以及作物高效栽培的重要途径。

目前，针对多种作物进行的氮高效种质的筛选普遍认为，氮高效种质的筛选应满足以下条件：一是材料来源广泛具有代表性且遗传基础丰富多样；二是适宜的筛选条件，即评价指标、筛选压力、筛选时期和评价方法等。关于氮效率评价指标的选择主要集中在作物生长特性、根系、产量、氮素积累等方面，利用这些指标进行的氮效率筛选都获得了较为理想的研究结果。作物氮高效种质通常表现为高的生物产量（营养体、果实和籽粒）、氮浓度、氮积累量、叶数等［7-8］。另有研究认为，包括根长和根体积在内的根系形态参数会影响作物地上部的生长和氮素吸收，进而影响氮效率的高低［9-10］。因此，生物量、根系参数和氮素积累是当前评价植物氮效率的常用参数。另外，在筛选时期的选择上研究者普遍认为，生育前期为作物对养分吸收的敏感时期，与成熟期的氮营养相关指标的性状存在显著相关性［11］，并且苗期试验周期短，适合对大规模材料进行氮效率初筛，苗期对作物进行氮效率的评价是简单、快速、可靠的科学方法。

紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界上栽培最早、分布最广的多年生豆科牧草，与禾谷类作物相比可以大大提高粗蛋白质的产出，是解决我国畜牧业发展中蛋白饲料资源短缺的重要途径和有效方法［12］。作为豆科牧草，紫花苜蓿的生物固氮过程可为其生长发育提供氮素营养，但并不能完全满足其生长所需［13］。为此，实践中为了达到优质高产的生产目的，必须确保高效生产的氮素所需，施用氮肥成为紫花苜蓿优质高效生产的必要保证。因此，氮肥使用量的逐年增加是促进紫花苜蓿高产的重要因素之一。然而，施氮也会带来一系列的不良影响，并且由此引起的“氮阻遏”效应，不仅大大降低了生物固氮这个自然界最为主要的氮积累途径的效率［14-15］，还会造成严重的环境问题［16］。而挖掘紫花苜蓿自身氮高效的遗传潜力、开发氮高效利用是提高其营养效率的重要途径之一，也是最快速、最易于推广“减肥”农业生产目标的方法。目前，已在实践中发现紫花苜蓿对氮肥的响应确实存在品种间差异，氮肥对生产性能的促进作用明显不同，品种间肥料报酬率存在极显著差异［17］。因此，开展紫花苜蓿氮效率研究，了解其品种间氮效率差异特征及规律，有助于制定优化牧草生产和减少养分损失的施肥管理策略，对优质高效生产具有重要的理论价值和实践意义，也是进一步筛选氮高效种质、培育兼具高产与节肥新品种的必要基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选用来源较为广泛，同时代表性强、遗传背景丰富的紫花苜蓿品种为试验材料（表1）。根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）为“中华12531”，由甘肃农业大学提供。

表1 紫花苜蓿品种及编号Table 1 Alfalfa cultivars and their marked numbers

1.2 试验设计

试验于 2016 年在甘肃农业大学控温室内进行（光照 28 ℃/14 h，黑暗20 ℃/10 h，光照强度 260～350 mol·m-2·s-1，相对湿度60%～70%）。试验为28 个品种×2 个氮水平=56 个处理。试验选用均一且饱满的紫花苜蓿种子进行播种，播种前先进行消毒（70%酒精浸泡5 min，再用蒸馏水清洗3 遍），同时对播种的细砂用蒸馏水反复清洗，并用烘箱进行灭菌和烘干（120 ℃烘5 h 以上）；播种时，将消毒后的紫花苜蓿种子撒播至直径9 cm、高12 cm 装有灭菌砂的营养钵中，待出苗后，每盆保留10 株健壮幼苗。长至2 叶1 心时，进行不同氮水平的处理（500 mL·盆-1营养液），用蒸馏水每周进行冲洗，至沙子中积累的盐分冲洗干净后再重新浇入营养液。长至3 片复叶时，每盆接种根瘤菌液（25 mL·盆-1，OD600为0.63～0.64）。处理35 d（苗期，根瘤已形成）后将紫花苜蓿茎叶和根系分开取样，进行形态和营养指标的测定。以Hoagland-Arnon 营养液为基本营养液，以NO3--N∶NH4+-N=1∶1（m∶m）为氮源，设低氮（2.1 mg·L-1）和适宜氮（210 mg·L-1，该氮素水平为本团队筛选出的紫花苜蓿最适宜氮素浓度［18］）2 个水平，分别以 N2.1和 N210表示，调节营养液 pH 为 7，每个处理重复 6 次。

1.3 测定指标

紫花苜蓿氮效率高低主要是由其生物量和氮素积累量高低决定的。株高的大小一般可以反映植株生长的快慢，根长和根体积一般可以反映植株对营养物质吸收的好坏。因此，本研究选用地上/地下干物质重、全株干物质重、株高、根长、根体积、地上/地下氮含量、全株氮含量、地上/地下氮积累量、全株氮积累量等指标对不同紫花苜蓿种质进行氮效率评价指标的筛选以及氮效率的划分。

采用直尺测定垂直高度（茎基部到生长点的距离）；通过EPSON Expression 扫描仪（10000XL，杭州）和WinRHIZO 分析系统测定根系总长度和根体积；采用烘干法测定干物质重；采用半微量凯氏定氮法测定氮含量；氮素积累量=干物质量×氮含量［19］。

1.4 数据分析

采用隶属函数法将紫花苜蓿氮效率评价指标进行综合评价［20］。采用Excel 2007 进行数据整理和图表绘制，采用SPSS 17.0 进行显著性方差分析。

2 结果与分析

2.1 紫花苜蓿苗期性状的分析

2.1.1 不同氮水平对株高、干物质重的影响 LW6010 在N2.1和N210水平下（表2），其株高、地上干物质重、地下干物质重和全株干物质重均显著高于其他品种（P＜0.05）。游客在N2.1下，其株高显著小于其他品种；精英和威斯顿在N210下，其株高显著小于其他品种（P＜0.05）。公农3 号在N2.1和N210下均表现为地上干物质重显著小于其他品种（P＜0.05）。公农3 号在N2.1和甘农4 号在N210下，其地下干物质重显著小于其他品种（P＜0.05）。赛迪7 在N2.1下，其全株干物质重显著低于其他品种（P＜0.05）。

表2 不同紫花苜蓿品种株高和生物量在不同氮素水平下的差异Table 2 Differences of plant height and biomass of different alfalfa cultivars under different nitrogen levels

2.1.2 不同氮水平对根长、根体积的影响 不同品种紫花苜蓿的根长和根体积在不同氮素水平下均表现不同（表3）。N2.1下，甘农9 号的根长最长，其次为皇冠，陇东苜蓿最短；N210下，皇冠最长，公农3 号最短。N2.1下，新疆大叶根体积最大，陇东苜蓿最小；N210下，甘农7 号最大，甘农4 号、甘农5 号、公农3 号和赛迪10 较小。

表3 不同紫花苜蓿品种根长和根体积在不同氮素水平下的差异Table 3 Differences of root length and root volume of different alfalfa cultivars under different nitrogen levels

2.1.3 不同氮水平对氮含量的影响 巨能601 在N2.1和N210下（表4），其地上氮含量和全株氮含量均显著大于其他品种（除LW6010）（P＜0.05）。N2.1下，甘农9 号地下氮含量显著大于其他品种；N210下，公农1 号显著大于其他品种（P＜0.05）。

表4 不同紫花苜蓿品种氮含量在不同氮素水平下的差异Table 4 Differences of nitrogen content of different alfalfa cultivars under different nitrogen levels（%）

2.1.4 不同氮水平对氮积累量的影响 LW6010 在N2.1和N210下（表5），其地上氮积累量、地下氮积累量和全株氮积累量均显著大于其他品种（P＜0.05）。N2.1下，甘农3 号的地上氮积累量显著小于其他品种；N210下，赛迪7和游客地上氮积累量显著小于其他品种（P＜0.05）。N2.1下，陇东苜蓿、公农1 号、赛迪7 和精英地下氮积累量均显著小于其他品种（P＜0.05）。N2.1下公农3 号和N210下赛迪7 和游客的全株氮积累量均小于其他品种（P＜0.05）。

表5 不同紫花苜蓿品种氮积累在不同氮素水平下的差异Table 5 Differences of nitrogen accumulation of different alfalfa cultivars under different nitrogen levels（mg·plant-1）

2.2 紫花苜蓿各性状的变异分析

28 个紫花苜蓿品种在N2.1和N210下各指标的变异幅度相差较大（表6）。N2.1下，各指标变异系数范围为10.8%～29.1%，其中地上部氮积累量最大，为29.1%；单株氮含量最小，为10.8%。N210下，各指标变异系数范围为9.4%～29.4%，其中地上部氮积累量变异系数最大，为29.4%；地下部氮含量最小，为9.4%。同时，在N2.1和N210下，地上部氮积累量、单株氮积累量、地下部氮积累量、地下部干重、根体积、地上部干重、单株干重和根长8个指标的变异系数较大（CV≥20%）；而株高、地下部氮含量、单株氮含量、地上部氮含量4 个指标的变异系数较小（CV＜20%）。此外，地上部干重、地下部干重、株高、地下部氮含量、地下部氮积累量在N2.1下的变异系数均大于N210，其余指标相反。

表6 紫花苜蓿苗期各性状在不同氮水平下的变化幅度Table 6 Traits variations of alfalfa cultivars at the seedling stage under different nitrogen levels

2.3 相关性分析

N2.1下，地上部干重、单株干重、根长、根体积、地上部氮积累量、地下部氮积累量、单株氮积累量之间呈极显著正相关，相关系数0.522～0.950（表7）。N210下，地上部干重、单株干重、株高、根长、根体积、地上部氮积累量、单株氮积累量之间呈极显著正相关，相关系数0.538～0.996。在低氮和正常氮条件下，地上部干重、单株干重、根长、根体积、地上部氮积累量和单株氮积累量之间均呈极显著正相关关系。

表7 不同氮水平下紫花苜蓿苗期各指标的相关性分析Table 7 Correlation of different alfalfa parameters at seedling stage under different nitrogen levels

2.4 评价指标隶属函数综合值分析

通过客观赋权得到评价指标的权重值（表8）。通过隶属函数法和复合运算得到不同紫花苜蓿品种的氮效率综合指数（表9）。N2.1下，最大相差66 倍，LW6010、巨能601、甘农5 号综合指数大于80%。N210下，最大相差14倍，LW6010、巨能601、甘农5 号、龙牧806 大于80%。在N2.1和N210下，均在40%以下的6 个品种分别是陇东苜蓿、威斯顿、巨能6、公农1 号、游客和赛迪7。

表8 不同氮水平下紫花苜蓿各评价指标的权重Table 8 Weights of evaluation indices of different alfalfa cultivars under different nitrogen levels

表9 不同氮水平下紫花苜蓿氮效率隶属函数综合指数Table 9 Integrated values of nitrogen use efficiency under different nitrogen levels

2.5 氮效率类型划分

通过不同品种在N2.1和N210下的综合指数（图1），可将紫花苜蓿品种分为4 类：高效型，LW6010、甘农5 号、龙牧 806、巨能 2、巨能 601 在 N2.1和 N210下综合值均大于 0.5；常效型，甘农 3 号、甘农 4 号、新疆大叶、新牧 1 号在 N2.1下综合值小于 0.5，在 N210下大于 0.5；反效型，甘农 7 号、甘农 9 号、龙牧 801、公农 3 号、精英、赛迪 10、巨能 551 在N2.1下综合值大于0.5，在N210下小于0.5；低效型，陇东苜蓿、甘农8 号、公农1 号、驯鹿、金黄后、威斯顿、游客、巨能6、阿尔冈金、赛迪7 在N2.1和N210下综合值均小于0.5。

图1 紫花苜蓿氮效率类型划分Fig.1 Classification of nitrogen efficiency of alfalfa

3 讨论

在本研究中，不同紫花苜蓿品种苗期生物量、根系参数和氮素积累量等氮营养相关指标存在显著差异性，这与小麦［21-22］、水稻［23-24］、玉米［25-26］、大豆（Glycine max）［27-28］等的研究结果一致，表明供试紫花苜蓿基因型的氮素营养性状具有较大的遗传变异，即品种间存在氮效率差异，此结果也很好地印证了本团队的前期研究发现［17］。

通过变异系数和相关性，本研究得出地上干物质重、全株干物质重、根长、根体积、地上氮积累量和全株氮积累量可作为苗期氮效率筛选的评价参数。在低氮和适宜氮水平下，紫花苜蓿地上干物质重、全株干物质重、根长、根体积、地上氮积累量和全株氮积累量等指标的变异系数较大，同时相互之间的相关性较高，表明该指标可以有效区分不同紫花苜蓿品种间的差异，适于筛选氮效率类型。同样，在现有的评价体系中，氮效率的评价参数也主要集中在生长特性、根系、产量和氮素积累等方面。例如，刘敏娜等［29］选择地上部干物质量作为菠菜（Spinacia oleracea）苗期氮效率的主要评价指标，地上部氮积累量、氮素吸收效率和氮素利用效率为辅助指标。李梁等［11］认为相对分蘖数、相对茎叶干重和相对整株干重可作为大麦（Hordeum vulgare）苗期氮高效评价指标。匡艺等［30］认为氮素利用率是主要指标，株高、地上部生物量可作为小黑麦氮高效评价辅助指标。同时，氮高效紫花苜蓿品种的地上干物质重、全株干物质重、根长、根体积、地上氮积累量和全株氮积累量无论在低氮还是高氮水平下均显著高于氮低效品种，这也进一步说明该指标具有明显的代表性，可作为氮效率评价的指标。氮高效甘蓝型油菜在根和茎生物量、根形态、氮积累、氮肥吸收效率等方面也表现出比氮低效品种更高的值［31］。根长和根体积代表了作物对氮素的吸收能力，而作物在生长前期对氮素的吸收能力又对其生长发育起关键作用［32］。本研究中，根长和根体积与干物质重和N 积累呈极显著正相关，这是因为根系发达，吸氮效率更高，生物量增加，植物氮积累量更大［33］。魏海燕等［34］对水稻的研究也指出根系的吸收能力是获得更高地上生物量的基础。因此，地上干物质重、全株干物质重、根长、根体积、地上氮积累量和全株氮积累量作为苗期筛选的评价参数是合理的。

对28 个不同来源紫花苜蓿品种的氮效率关键指标通过隶属函数法进行综合评价和分析，这与使用类似氮效率参数评估作物氮效率的单一或平均表现的研究不同，由于作物氮素效率非常复杂，进行更全面地分析评价，可以得到更准确的结果。目前，使用该方法进行氮效率筛选也被越来越多的研究者们认可［35-36］。研究中发现，紫花苜蓿氮效率表现为以下特征：LW6010 和甘农5 号等品种无论环境氮充足还是缺乏均表现为氮营养高效；甘农3号、甘农4 号等品种在环境氮水平充足时表现为氮营养高效，缺乏时表现为氮营养低效；甘农7 号、龙牧801 等品种在环境氮充足时表现为氮营养低效，缺乏时却表现为氮营养高效；陇东苜蓿等品种无论环境氮充足还是缺乏均表现为氮营养低效，不同品种表现出了明显不同的氮效率差异规律，因此，根据本研究中紫花苜蓿所表现出氮效率特征的不同，将其按氮效率特征划分为4 个类型，并分别命名为：氮高效型、氮常效型、氮反效型和氮低效型。不同作物的氮效率类型有不同的分类。例如，Tsai 等［37］将玉米分为3 种氮效率类型，敏感型、中间型和非敏感型，在这一分类中，敏感型可以代表作物对环境氮的响应能力，而不能代表作物的氮效率。Kumar 等［38］对玉米氮效率的分类为高效与响应型、非高效与响应型、非高效与非响应型、高效与非响应型。He 等［6］将油菜品种分为4 种氮效率类型：氮响应型、氮无响应型、氮高效型和氮低效型。这些类型的划分标准均是以不同作物品种对氮素的不同响应。Chen 等［35］，刘敏娜等［29］和赵春波等［39］分别将玉米、菠菜和黄瓜（Cucumis sativus）分为 4 类：高效型、高氮高效型、低氮高效型、低效型，明确指出了环境氮素与作物的关系。在本研究中，氮效率类型直接反映了苜蓿的氮效率，类型划分及命名更为直观。同时，本研究将紫花苜蓿氮效率进行了量化，即通过地上干物质重、全株干物质重、根长、根体积、地上氮积累量和全株氮积累量6 个指标在低氮和适宜氮下进行综合分析，并通过其综合值进行划分，即低氮和适宜氮下其综合值均大于0.5 为氮高效型；低氮下小于0.5，适宜氮下大于0.5 为氮常效型；低氮下大于0.5，适宜氮下小于0.5 为氮反效型；低氮和适宜氮下均小于0.5 为氮低效型。相对前人研究而言（以不同品种间对氮素响应的差异和比较来划分氮效率类型），本研究通过量化指标进而对氮效率进行划分更为直观、便捷，也具有较高的可重复性，同时对单个紫花苜蓿品种也可以通过此方法进行快速氮效率类型的认定。

不同氮效率类型的紫花苜蓿具有不同的生理特点，其在生产中的管理和应用也不同。可以根据紫花苜蓿的氮效率类型特征有针对性地施用氮肥，以达到高产优质的目的，提高氮肥利用率，减少浪费［40］。在本研究中，氮高效型紫花苜蓿品种具有较强的适应性和较高的利用价值。因此，LW6010 和甘农5 号等品种比其他品种可少施氮肥，同时表现出较好的产量和品质。Chen 等［35］发现高效型玉米品种的平均产量高于所有受试品种，在低氮、常氮和高氮条件下，高效型品种的产量分别比所有供试品种的平均产量高15.00%、6.62%和7.57%，潜在的氮肥节约量为25.2%～15.9%。Worku 等［41］报道表明，高效型玉米品种有可能增产10.7%，减少氮肥投入12.7%。因此，氮高效型紫花苜蓿可适用于所有农业系统，并且降低氮肥施用。对于常效型紫花苜蓿品种，本研究建议可通过适当施氮来提高产量，如甘农3 号和甘农4 号等。本团队前期研究发现，施氮后，甘农3 号的株高、产量和品质均显著高于陇东苜蓿［18］，说明常效型品种具有较高的肥料利用率。Chen 等［35］研究表明，如果在华北和东北地区使用高效型和/或常效型玉米品种，产量可提高10%～15%，氮肥投入可减少10%～20%。氮反效型紫花苜蓿品种甘农7 号和甘农9 号对土壤低氮的耐受性强于其他类型，因此，它们可以在氮肥用量较少的土地上生长。对于氮低效型紫花苜蓿品种，虽然其氮效率低，对外源氮素不敏感，但其却具有其他方面的优势，例如陇东苜蓿因其具有较强的抗逆性，使其成为优良的地方品种。总的来说，氮效率的分类不仅可以发掘高效氮种质资源，而且可以指导紫花苜蓿生产中氮营养管理的针对性施肥。

4 结论

通过对不同紫花苜蓿品种苗期性状的变异分析和隶属函数综合值分析，得出地上干物质重、全株干物质重、根长、根体积、地上氮积累量和全株氮积累量可作为氮效率的筛选指标。

根据氮效率筛选指标的差异，并量化其综合值，在这个标准下可将紫花苜蓿分为4 个类型：氮高效型、氮常效型、氮反效型和氮低效型。