HPLC法测定蒙成药萨仁-嘎日迪中羟基红花黄色素A的含量

李玉华 姜 楠 李景清 安文源

内蒙古自治区通辽市食品药品检验所,内蒙 通辽 028000

萨仁-嘎日迪由红花、黑云香、草乌、诃子、丁香、水银(制)、石菖蒲、木香、硫黄、白硇砂、苘麻子、白云香(枫香脂)、草决明、苏格木勒、草果仁、海金沙、方海、石膏、肉豆蔻、人工麝香、人工牛黄等二十一味药组成。具有消“粘”肿，燥“协日乌素”，祛“亚玛”等功效，用于治疗半身不遂，左瘫右痪，风湿骨痛，白喉，疮疡脓肿，鼻炎，偏头痛等症[1-2]。方中主药红花，性温，味辛，具有散瘀止痛、活血通经、抗肿瘤、抗菌、抗疲劳等多种生理活性[3-5]。作为临床常用的蒙药医院制剂，萨仁-嘎日迪疗效确切，未见任何不良反应发生。但目前为止，该成药质量标准还停留在1984年版《内蒙古蒙成药标准》阶段，只有简单的外观性状和检查项目[6]。以红花中主要活性成份羟基红花黄色素A为指标，建立萨仁-嘎日迪中羟基红花黄色素A含量测定的方法，能有效控制该成药的内在质量，为该成药质量标准的提升提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪(四元梯度泵，二级管阵列检测器，Empower色谱工作站)，Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪(紫外检测器，LabSolution工作站)，92SM-202A型电子天平，XS3DU电子天平，KQ5200DE超声波清洗机。

1.2 试药 对照品羟基红花黄色素A(批号：110637-201810，含量93.1%)由中国食品药品检定研究院提供；水为高纯水，甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。4批萨仁-嘎日迪医院制剂来源见表1。

表1 萨仁-嘎日迪成药来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件[7-9]InertSustain AQ-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相为用三乙胺调至pH*6.0±0.1)的甲醇-乙腈-0.7%磷酸(19.5∶1.5∶79)，流速为1.0 mL/min，检测波长403 nm，柱温40 ℃，进样量为10 μL。记录时间20 min，理论板数按羟基红花黄色素A峰计算，应不低于4000。

2.2 对照品、供试品溶液及阴性对照品的制备 精密称取羟基红花黄色素A对照品7.514 mg，置50 mL量瓶中，加25%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.1503 mg/mL的羟基红花黄色素A对照品贮备液。精密吸取该对照品贮备液2 mL，置10 mL量瓶中，加25%甲醇至刻度，摇匀，即得羟基红花黄色素A(30.06 μg/mL)对照品溶液。

取样品粉末(过四号筛)约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率50 Hz)30 min，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液经 0.45 μm 微孔滤膜滤过后作为供试品溶液。

取处方中除红花以外的二十味药材，粉碎成细粉，按处方比例称重，其中人工麝香、人工牛黄需与其它药材细粉配研，所有药材粉末混合均匀，过筛，凉开水泛丸，银朱包衣，打光，干燥，即得阴性对照品。

2.3 专属性试验 取按处方比例制备的不含红花药材的阴性对照品，按“2.2”项下供试品溶液制备法制得阴性对照品溶液。在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、阴性对照品溶液、供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果阴性对照品色谱图中在与羟基红花黄色素A对照品以及供试品色谱图相对应的保留时间处无色谱峰出现，表明该方法专属性强，其他组分对羟基红花黄色素A的测定无干扰。色谱图如图1所示。

A.对照品；B.供试品；C.阴性对照1. 羟基红花黄色素A 图1 对照品、供试品及阴性对照品图谱

2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.2”项下羟基红花黄色素A对照品贮备液(0.1503mg/mL)200、1000、2000、4000、6000、8000 μL，置于10 mL量瓶中，用25%甲醇稀释定容后得到3.006、15.03、30.06、60.12、90.18、120.24 μg/mL系列浓度的对照品溶液。精密吸取上述各梯度浓度的对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以对照品峰面积Y为纵坐标，相应的对照品的量X为横坐标，得到羟基红花黄色素A回归方程为：Y=34186X，r=0.9999。表明羟基红花黄色素A在0.03006～1.2024 μg范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 按“2.2”项下供试品溶液配制方法，精密称取扎鲁特旗蒙医院制剂室提供，批号为20190128的2号样品2.0115 g，按“2.2”项下供试品溶液制备法配制成精密度试验溶液，精密吸取该溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积。重复进样6次，测得峰面积的RSD值为0.64%，表明该方法精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密称取扎鲁特旗蒙医院制剂室提供，批号为20190128的2号样品2.0053 g，按“2.2”项下方法配制供试品溶液，精密吸取该溶液10 μL，分别于0、2、4、6、12、24 h注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积。结果24 h内峰面积的RSD值为0.93%，表明该方法提取的样品溶液在24 h内基本稳定。

2.7 重复性试验 精密称取扎鲁特旗蒙医院制剂室提供，批号为20190128的2号样品6 份，每份约2.0 g，按“2.2”项下方法配制供试品溶液，精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，计算含量。结果6份平行样含量平均值为0.3711 mg/g，RSD为1.15%。表明该方法重复性良好。

2.8 加标回收率试验 取已测得含量的样品(扎鲁特旗蒙医院制剂室提供，批号为20190128，含量为0.3711 mg/g)9份，每份约1.0g，每三份一组，精密称定，置具塞锥形瓶中，再精密加入羟基红花黄色素A对照品贮备液(0.1503 mg/mL)1250、2500、3750 μL，按“2.2”项下供试品溶液配制方法，配制成高、中、低3个浓度的加标回收溶液，精密量取各加标回收溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算回收率，结果见表2。3个浓度加标回收率平均值为97.38%，RSD值为0.88%。

表2 回收率试验结果 (n=9)

2.9 色谱柱、仪器设备的耐用性试验 换不同厂家、不同型号的色谱柱及不同的液相色谱仪，取扎鲁特旗蒙医院制剂室提供，批号为20190128的2号样品，精密称定，按“2.2”项下供试品溶液制备方法提取制备样品溶液，精密吸取该样品溶液10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，计算样品中羟基红花黄色素A含量。结果见表3。从表中数据可以看出，羟基红花黄色素A含量变化不大(RSD为1.05 %)，表明该方法对不同色谱柱和仪器设备耐用性良好。

表3 不同色谱柱、不同仪器的耐用性试验

2.10 样品含量测定[10]分取4个厂家提供的萨仁-嘎日迪样品粉末约2.0g，精密称定，按“2.2”项下供试品溶液制备方法提取制备样品溶液，精密吸取各样品溶液10 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，测定结果见表4。

表4 4批萨仁-嘎日迪样品中羟基红花黄色素A含量测定结果 (n=3)

续表4 表4 4批萨仁-嘎日迪样品中羟基红花黄色素A含量测定结果 (n=3)

从表4数据可以看出：不同医院制剂室提供的4批成药中，羟基红花黄色素 A 的含量存在着明显的差异。考虑到所用的红花药材之间的含量差异，同时对各批成药相对应的红花原药材的含量进行了测定，计算出各批成药中羟基红花黄色素A的转移率。结果见表5。

表5 4批萨仁-嘎日迪样品羟基红花黄色素A转移率 (n=3)

表5中数据显示，不同制剂室生产的4批成药中，萨仁-嘎日迪中羟基红花黄色素A的平均转移率在75.5%～100.0%之间。参考《中国药典》2015 年版一部“红花”含量测定项下规定含羟基红花黄色素 A 量不得少于 1.0%[8]，结合各批成药的平均转移率，暂定本品每1 g含红花以羟基红花黄色素A(C27H32O16)计，不得少于0.33 mg。

3 讨论

参照《中国药典》2015[6]年版一部“红花”含量测定项下羟基红花黄色素A的测定方法[8]，以甲醇-乙腈-0.7%磷酸(26∶2∶72)为流动相，结果目标峰羟基红花黄色素A拖尾因子1.49，拖尾严重，调整流动相比例甲醇-乙腈-0.7%磷酸(19.5∶1.5∶79)，并用三乙胺调至pH(6.0±0.1)，此时目标峰羟基红花黄色素A拖尾因子1.102，与其它干扰组分分离较好，保留时间适宜，理论塔板数较高。故作为检测流动相。

成药粉末以25%甲醇作为提取溶剂进行超声提取(功率120 W，频率40 kHz)，为保证被测成分提取完全，实验中考察了超声提取40、50、60 min不同超声提取时间对提取效率的影响，结果羟基红花黄色素A的含量基本一致(RSD 0.51%)，故提取时间定为40 min。

通过专属性，精密度，稳定性、重复性试验，色谱柱及不同仪器设备的耐用性考察，结果表明该方法准确可靠，可作为萨仁-嘎日迪中羟基红花黄色素A含量测定的方法。