甘蔗ScCRT1 基因克隆及其应答SCMV 侵染分子机制的研究

张 海 程光远 杨宗桃 王 彤 刘淑娴 商贺阳 赵 贺 徐景升

福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心 / 农业农村部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室 / 教育部作物遗传育种与综合利用重点实验室, 福建福州 350002

钙网蛋白(calreticulin, CRT)在真核生物中高度保守并广泛表达[1-4], 主要定位于内质网(endoplasmic reticulum, ER)和胞间连丝(plasmodesmata, PD), CRT是内质网中主要的Ca2+结合蛋白, 具有分子伴侣功能[5-8]。Ca2+是细胞内重要的第二信使, 在细胞信号转导中具有重要作用[5,9]。因此, CRT 参与调控Ca2+稳态、信号转导、内质网质控(endoplasmic reticulum quality control, ERQC)、生长发育和免疫应答等多种生物学过程[2-4,10-12]。CRT 在哺乳动物中的研究较为深入, 该蛋白除了上述基本生物功能外, 还参与了癌症等疾病的发生[13-14]。植物中CRT 的研究相对滞后[15], 研究表明CRT 广泛应答生物和非生物胁迫,参与干旱、低温、盐胁迫、真菌、细菌、病毒的侵染等逆境胁迫反应[2,4,8,16-21]。

甘蔗(Saccharumspp. hybrid)是我国和世界上最重要的糖料作物和能源作物[22-24]。甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)属于马铃薯Y 病毒科(Potyviridae) Y 病毒属(Potyvirus), 是甘蔗花叶病的主要病原之一, 严重危害甘蔗生产[25-28]。SCMV为单链正义RNA 病毒, 长度约为10 kb, 编码2 个多聚蛋白, 经自身编码的蛋白酶裂解后形成11 个成熟的功能蛋白, 从N 端至C 端分别为P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、NIb 和CP蛋白[29-32]。其中, 6K2 蛋白参与病毒的复制、胞内与胞间移动, 在马铃薯Y 病毒属病毒建立系统性侵染过程中起着至关重要的作用[33-37]。

本课题组在前期研究中, 以SCMV 编码的6K2蛋白为诱饵, 从甘蔗品种ROC22 叶片cDNA 酵母文库中筛选到了具有完整开放读码框(open reading frame, ORF)的CRT基因, 其长度为1281 bp。在本研究中, 我们进一步从Badila 叶片中克隆了该基因,命名为ScCRT1。本研究利用 RT-qPCR 分析了ScCRT1基因在甘蔗不同组织中的表达特异性以及应答 SCMV 侵染的表达情况; 利用酵母双杂交(yeast 2 hybrid, Y2H)和双分子互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)技术验证了ScCRT1 蛋白与SCMV-6K2 的互作关系; 利用瞬时表达试验, 研究了ScCRT 的亚细胞定位。本研究为研究SCMV 侵染甘蔗的分子机制提供了实验证据, 并为甘蔗抗花叶病育种提供了基础数据和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料及处理方法

SCMV 病毒、甘蔗品种Badila 组培苗、本氏烟(Nicotiana benthamiana)苗由福建农林大学农业农村部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室提供。2019 年11 月, 待组培苗长至15～25 cm、完全展开叶出现4～5 片时, 摩擦接种SCMV, 设置3 个重复,每个重复5 株, 对照植株使用磷酸缓冲液(pH 7.0)摩擦接种, 使用SCMV-CP基因特异引物(表1)检测接种是否成功。分别在接种后0 h、4 h、8 h、12 h、18 h、1 d、2 d、3 d、4 d 取样, 研究目的基因应答SCMV 侵染的表达模式。在隔离网室内随机选取9株处于伸长期且长势一致健康的Badila植株, 分成3 组, 每组3 株。取其白色嫩根、心叶(未展开的叶)、正一叶(甘蔗最高可见肥厚带的第一叶)、正四叶、第四节间、第八节间, 用于研究目的基因的组织表达特性。样品采集后用液氮速冻, 置于-80℃冰箱保存备用。

1.2 总RNA 提取和cDNA 合成

使用TRIzol (Invotrigen, USA)试剂, 按照说明书要求提取样品总RNA, 用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 质量。使用Nanodrop (Thermo Scientific,USA)测定RNA 的浓度, 按照Prime Script RT Reagent Kit 使用说明书, 将RNA 反转录成cDNA。

1.3 ScCRT1 基因的克隆及生物信息学分析

以筛选酵母文库获得的CRT基因序列为参考,通过同源克隆的方法, 在起始密码子和终止密码子附近设计ScCRT1基因的特异扩增引物(表1)。以反转录获得的cDNA 为模板, 使用PrimeSTAR GXL DNA polymerase (TaKaRa Bio, Japan)高保真酶, 参照Shinohara 等[38]的方法克隆ScCRT1基因, 并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

将测序获得目的基因序列, 利用 NCBI 中的ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)软件分析开放阅读框, 并获取其氨基酸序列。利用ProtParam (http://expasy.org/tools/protparam.html)预测蛋白的一级结构、理化性质; 利用GOR4 (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)、SignalP 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 和 TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分别预测分析其二级结构、信号肽和跨膜特性; 用 Blastp 在线工具查找ScCRT1 的同源氨基酸序列, 使用DNAMAN 6.0 软件多重比对同源氨基酸序列, 使用 ClustalX 和MEGA 7.0 的ML (maximum likelihood, LG+G)法构建系统进化树。

1.4 ScCRT1 的RT-qPCR 表达分析

根据ScCRT1基因的ORF 序列, 设计特异性实时荧光定量PCR 引物(表1), 以GAPDH基因和eEF-1α基因(表 1)作为内参基因[39]。按照 SYBR Green PCR Master Mix (Roche)说明书配制定量反应体系, 在荧光定量PCR 仪上完成定量PCR 扩增。每个样品设置3 次技术重复, 以无菌水作对照, 扩增程序为50℃ 2 min, 95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60℃1 min, 40 个循环。反应结束后, 采用2–ΔΔCt算法分析获得的数据[40]。

1.5 ScCRT1 的亚细胞定位

参照Cheng 等[29]的方法, 利用Gateway 方法将ScCRT1构建到pEarlyGate101 载体中, 获得ScCRT1亚细胞定位质粒 ScCRT1-YFP 并转入农杆菌EHA105中。取健康的本氏烟植株, 参照Cheng 等[29]农杆菌侵染方法, 将带有重组质粒的农杆菌注射入健康的本氏烟叶片。48 h 后在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP5II)下观察本氏烟叶片表皮细胞中ScCRT1 蛋白的定位, YFP 的激发光波长为514 nm,捕获波长为530～590 nm。

1.6 Y2H 验证ScCRT1 与SCMV-6K2 的互作

参照Zhang 等[34]的方法构建ScCRT1基因的诱饵载体pBT3-SET-ScCRT1, 利用Y2H 技术验证其与pPR3-N-SCMV-6K2 的互作关系。pTSU2-APP 和pNubG-Fe65 组合作为阳性对照, pNubG-Fe65 和pPR3-N 组合作为阴性对照, pBT3-SET-ScCRT1 和pPR3-N 组合为自激活验证。

1.7 BiFC 验证ScCRT1 与SCMV-6K2 的互作

参照Cheng 等[29]的方法构建ScCRT1-YC 载体,利用BiFC 技术验证其与YN-SCMV-6K2 的互作。YFP 的激发光波长为 514 nm, 捕获波长为530～590 nm; 叶绿素自荧光的激发光波长为552 nm,采集波长为650～680 nm。

2 结果与分析

2.1 ScCRT1 基因的克隆与生物信息学分析

经PCR 扩增和测序, 本研究从Badila中克隆了1 条ORF 长度为1281 bp 的CRT基因, 该基因编码426 个氨基酸。核苷酸序列比对表明, 该CRT 序列与高粱的CRT1 (Sorghum bicolor, XM_021451918.1)同源性高达96.49%, 将该基因命名为ScCRT1, 并提交GenBank, 登录号为MT635395。ProtParam 分析表明, ScCRT1 的分子量为48.22 kD, 等电点为4.43;不稳定系数为 35.67, 为稳定蛋白; 脂溶指数为63.29, 总平均亲水性是-1.023, 可能是亲水性蛋白。GOR4 预测表明, ScCRT1 中无规则卷曲占比最高,达到60.09%; 其次是延伸链和α 螺旋, 占比分别为20.19%和19.72%; 无β-折叠结构。跨膜结构域预测结果表明, ScCRT1 具有1 个跨膜结构域, 其分布在13～35, 膜向性为 i→o。SignalP 5.0 分析表明,ScCRT1 蛋白含有信号肽, 且信号肽的剪切位点位于第31 和32 号氨基酸之间(图1), 为分泌蛋白。

2.2 ScCRT1 的氨基酸序列同源性分析和系统进化树分析

典型的CRT 蛋白含有3 个不同的结构和功能域:高度保守的球状N-结构域, 其末端含有一个信号肽序列; P-结构域, 具有高亲和力和低Ca2+结合能力;C-结构域表现出低亲和力和高的Ca2+结合能力, 其末端包含有(K/H)DEL 内质网滞留信号[1-2]。在ScCRT1 氨基酸中发现具有上述典型的CRT 的3 个结构域组成, 残基1～31 的疏水信号肽序列, 残基32～216 的球形N-结构域, 残基217～313 的富含脯氨酸P-结构域, 残基314～426 的多酸性氨基酸C-结构域并含有内质网滞留信号HDEL 基序(图1)。通过NCBI 网站的 Blastp 和 Phytozome 网站的 Proteome Blastp 搜索 ScCRT1 同源序列, 结果显示,ScCRT1 蛋白与高粱(XP_021307591.1)、玉米(Zea mays, XP_008670080.1)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon, XP_003563166.1)、谷子(Setaria italic,XP_004981159.1)、水稻(Oryza sativa, XP_01562 8738.1)和拟南芥(Arabidopsis thaliana, NP_176030.1)的CRT 蛋白相似度分别为96%、90%、92%、86%、78%、72%。对甘蔗及其他物种CRT 蛋白的氨基酸序列同源性分析表明, 在其N-结构域和P-结构域氨基酸序列高度保守, 信号肽序列和C-结构域氨基酸序列因物种的不同表现出明显的差异(图1)。

使用ClustalX 和MEGA 7.0 的ML (maximum likelihood, LG+G)法构建系统进化树, 分析ScCRT1蛋白与其他物种CRT 蛋白的进化关系。结果表明,植物CRTs 蛋白主要分为2 种亚型: CRT1/CRT2 亚型和 CRT3 亚型。在拟南芥中 CRT 含有 AtCRT1(AT1G56340.2)、AtCRT2 (AT1G09210.1)和AtCRT3(AT1G08450.1) 3 种蛋白, 包括2 个蛋白亚型; 其中AtCRT1 与AtCRT2 相似性很高, 为CRT1/CRT2 亚型; AtCRT3 为CRT3 亚型, 该亚型与CRT1/CRT2 亚型存在着较大差异[41-42]。基于进化树分析, 我们克隆的ScCRT1 蛋白属于CRT1/CRT2 亚型(图2)。

单子叶植物甘蔗、高粱、柳枝稷(Panicum virgatum)、水稻、谷子、大麦(Hordeum vulgare)、二穗短柄草形成群I; 双子叶植物烟草(Nicotiana tabacum)、葡萄(Vitis vinifera)、三叶杨(Populus trichocarpa)、大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago sativa)、拟南芥形成群II (图2)。在遗传进化上, CRT 蛋白在单子叶植物和双子叶植物之间存在明显的分化。

2.3 ScCRT1 的亚细胞定位

在激光共聚焦显微镜下观察烟草瞬时表达ScCRT1-YFP 融合蛋白的黄色荧光在细胞内的分布(图3); ScCRT1-YFP 融合蛋白的黄色荧光信号为典型的内质网定位信号, 表明其主要定位于内质网。

2.4 ScCRT1 基因的组织特异性表达及应答SCMV 侵染的表达模式

基于RT-qPCR 技术, 以根中ScCRT1基因的表达量为参照基准, 采用 2–ΔΔCt法对甘蔗各组织ScCRT1基因表达量的分析结果(图4)表明,ScCRT1基因的表达具有明显的组织特异性, 在不同组织中的表达量差异较显著, 其在心叶中的相对表达量最高, 根和正一叶次之, 第八节间中表达量最少。使用SCMV-CP基因特异引物(表1)检测SCMV 接种的甘蔗, 选出扩增出目的片段的样品, 进行ScCRT1基因应答SCMV 侵染的RT-qPCR 试验。结果显示SCMV的侵染对ScCRT1基因表达的影响显著, 与对照相比,ScCRT1基因在侵染早期显著上调, 在12 h 时表达量达到最大值, 然后下调表达, 但仍显著高于对照(图5)。

2.5 ScCRT1 与SCMV-6K2 的互作验证

Y2H 试验结果显示, pBT3-SET-ScCRT1 和pPR3-N 共转酵母细胞NMY51和阴性对照在添加了5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)的SD/-Leu/-Trp (DDO)培养基上生长, 但在添加了X-Gal 的SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade (QDO)培养基上不生长; pBT3-SET-ScCRT1 和pPR3-N-SCMV-6K2 共转的酵母菌株NMY51和阳性对照在添加了X-Gal 的DDO 和QDO培养基上可以生长并呈现蓝色(图6)。表明pBT3-SET-ScCRT1 不具有自激活性; ScCRT1 与SCMV-6K2 蛋白在体外互作。

BiFC 试验结果表明, 共注射的 YN-6K2 和ScCRT1-YC 在本氏烟叶片表皮细胞中产生黄色荧光信号(图7), 说明ScCRT1 与SCMV-6K2 互作, 这与Y2H 试验结果一致, 进一步表明 ScCRT1 与SCMV-6K2 互作。

3 讨论

尽管病毒与寄主相融, 但是病毒侵染仍然会对寄主造成胁迫, 导致寄主在转录组水平对基因表达进行重新编程, 产生大量差异表达基因[43-46]。本课题组前期研究表明, 甘蔗花叶病另外1 个主要病原甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV,Poacevirus)侵染甘蔗品种FN40导致CRT基因表达上调[45]。本研究中,ScCRT1基因在SCMV侵染早期表达上调, 随着时间加长逐渐下降, 但仍显著高于对照。该结果与番木瓜PaCRT基因应答番木瓜环斑花叶病毒(Papaya ringspot virus, PRSV,Potyvirus)侵染的表达模式相似[21]。这些研究结果表明,CRT应答病毒侵染的分子机制可能相同, 这也与CRT 蛋白结构保守的特性相符。ScCRT1 主要定位在内质网中(图3)。定位于内质网的CRT 参与了Ca2+稳态调控和内质网质控, 对于Ca2+依赖的信号传导和新合成蛋白的正确折叠具有重要作用[9-10]。病毒侵染会造成内质网胁迫, 影响蛋白的正确折叠[45,47]。因此我们推测SCMV 侵染甘蔗也会造成内质网胁迫,干扰ScCRT1 作为分子伴侣协助蛋白折叠的功能,为此寄主上调ScCRT1表达以应答胁迫。

植物病毒与寄主长期协同进化[48]且结构简单,必须与寄主因子互作才能建立系统性侵染[49]。本研究利用Y2H 和BiFC 试验证明了SCMV-6K2 与ScCRT 的互作(图6 和图7), 互作位于内质网和细胞膜, 并且在细胞膜上出现点状结构。我们推测细胞膜上的互作位点有可能位于胞间连丝, 这种互作可能在侵染早期阻碍SCMV 胞间移动。马铃薯Y 病毒的胞间移动是以6K2 诱导内质网形成的囊泡的形式进行的[36-37], SCMV-6K2 与ScCRT1 互作于胞间连丝,可能由于CRT 的Ca2+调节功能, 导致胞间连丝位置Ca2+浓度升高, 激活胼胝质合成酶Cals[50], 促进胼胝质合成积累, 进而减小胞间连丝的通透性。在烟草应答烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV,Tobamovirus)侵染的研究中, 也有类似研究报道。烟草的NtCRT 与TMV 的运动蛋白互作, 过表达NtCRT严重影响TMV 的胞间移动[8]。在非生物逆境铝离子胁迫下, 小麦、烟草和苜蓿的CRT 上调表达, 与胼胝质共定位沉积于胞间连丝, 阻碍共质体运输[51-52]。这些研究结果表明, CRT 参与调节胞间连丝的通透性。Badila极易感染SCMV, 在侵染后期, ScCRT1的表达量下调, 推测胞间连丝胼胝质积累下降, 通透性增加, 便于SCMV 胞间移动, 最终建立系统性侵染。

病毒在寄主体内建立系统性侵染是一个动态的生物学过程, 6K2 不但参与病毒的复制和胞间移动,还参与了自噬调节[53], 6K2 除了与病毒自身编码蛋白CI、P3 互作[36,54-55]互作外, 还与很多寄主编码蛋白互作[34]。而CRT 可能还与病毒编码的其他蛋白互作, 比如番木瓜的 PaCRT 与番木瓜环斑病毒(Papaya ring spot virus, PRSV,Potyvirus)的HC-Pro互作[21]。因此, 阐明ScCRT1 在SCMV 侵染中的作用还需要进一步深入研究, 如Ca2+浓度的变化, 过表达或抑制ScCRT1的表达对SCMV 的复制和胞间移动的影响等。

4 结论

从甘蔗叶片中克隆到钙网蛋白基因ScCRT1,GenBank 登录号为MT635395。ScCRT1的ORF 长度为 1281 bp, 编码 426 aa。亚细胞定位试验表明,ScCRT1 蛋白定位于内质网; RT-qPCR 分析显示, 该基因在心叶等幼嫩组织中表达量较高; 在SCMV 侵染条件下,ScCRT1基因的表达呈先上调后下调的表达模式; Y2H 与 BiFC 试验表明, ScCRT1 与SCMV-6K2 蛋白互作。