pH微环境对成牙本质细胞增殖行为的影响

董少杰,梅钰坤,石昊羽,赵舒扬,牛 林,谷冬华,4*

(1西安交通大学口腔医院,陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室,西安 710004;2陕西省牙颌疾病临床研究中心;3西安交通大学口腔医院口腔修复科;4西安交通大学口腔医院口腔特诊特需科;*通讯作者,E-mail:27585859@qq.com)

龋病是口腔最常见的一类牙齿硬组织疾病,可破坏原有的牙体结构和功能完整性,若持续发展可引起牙髓症状,严重影响患者的生活质量[1]。传统的龋坏治疗方式为去净腐质、预备洞型后使用银汞合金、复合树脂等材料充填,但是存在力学传导性差、继发龋风险大及容易脱落、刺激牙髓等不足,使其强度、美学效果难与天然牙齿相媲美[2,3]。研究发现,牙本质受损后,近缺损处的成牙本质细胞可分泌牙本质基质蛋白,重建羟基磷灰石晶体,在受损处相对的髓腔壁处形成修复性牙本质以保护牙髓。因此,通过促进修复性牙本质形成实现龋坏组织的修复成为新的龋病治疗策略和研究热点[4]。

微环境的改变是促进修复性牙本质形成的重要因素。牙本质龋坏通常伴随牙本质小管口形态扭曲、有机基质及胶原纤维的降解等[5,6]。随着硬组织微观结构发生变化,氧分压、温度刺激、pH等成牙本质细胞生长微环境发生改变。尽管已有较多研究关注氧分压、温度刺激等因素对成牙本质细胞生物学行为的影响,但pH对成牙本质细胞增殖分化的影响则尚未见文献报道[7]。pH的改变既是龋坏进展的标志、也是龋坏进展的诱因[8,9],然而,目前对成牙本质细胞增殖分化及矿化能力的体外研究通常是在常规培养液中进行的,并不能反映细胞在龋洞的真实酸碱微环境。鉴于此,本研究拟通过精准调节培养基pH值模拟龋洞酸碱微环境,并以永生化小鼠成牙本质细胞系MDPC-23为研究对象,评价成牙本质细胞在龋洞低pH微环境下增殖行为特点,并期望为促进修复性牙本质形成这一龋坏治疗新策略提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM培养基(Gibco,美国)、胎牛血清(Gibco,美国)、0.25%胰蛋白酶(Gibco,美国)、盐酸溶液与氢氧化钠溶液(1 mol/L,西安交通大学实验室提供)、CCK8试剂盒(上海贝博生物公司)、MDPC-23细胞(美国佐治亚奥古斯塔大学Franklin Tay教授赠予)。

1.2 实验仪器

倒置相差显微镜及照相系统(FSX100,OLYMPUS,日本)、普通光学显微镜(DMLB,Leica,德国)、全自动高温高压灭菌锅(HV-50,Hirayama,日本)、恒温干燥箱(Eppendorf,德国)、数字化pH计(Sartorius,德国)。

1.3 不同pH龋洞微环境的模拟构建

用高温高压灭菌后的生理盐水将1 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液稀释至0.1 mol/L;在超净台内使用一次性无菌滤器过滤,确保溶液无菌、无杂质;将4个50 ml高压灭菌后的离心管编号为1,2,3,4,均加入20 ml DMEM培养基(含10%胎牛血清);使用移液器向1,2号离心管逐滴加入过滤后的HCl溶液,4号离心管加入过滤后的NaOH溶液。1-4试管各取1 ml培养液,用数字化酸度计测量pH值。根据测量结果调整酸碱溶液加入量,直至达到目标pH。培养液pH重复测量3次稳定后用于后续实验。

1.4 不同pH环境MDPC-23细胞形态观察

MDPC-23细胞接种至4个35 mm培养皿中,编号为A,B,C,D;用倒置显微镜观察记录实验细胞的贴壁生长情况;当细胞长至大约50%接触时,吸出培养液,PBS冲洗两遍,A,B,C,D分别加入pH值为5.5,6.5,7.5和8.5培养液;每8 h更换相应pH值的培养液,通过提高换液频次确保培养皿内pH环境保持相对稳定;48 h后倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.5 不同pH环境MDPC-23增殖活性检测

待MDPC-23细胞生长至80%接触时,用0.25%胰蛋白酶消化获取细胞悬液。取出0.5 ml细胞悬液加无菌水稀释10倍,以每中格的细胞量可查为度。取洁净的血球计数板(16×25规格),悬液摇匀,移液器吸取少许悬液滴加在计数区(计数区两边平台避免沾上细胞悬液,防止加盖盖玻片后计数区深度的升高),然后加盖盖玻片(避免产生气泡)。静置片刻使细胞沉降到计数板。将细胞计数板置于显微镜载物台,低倍镜下找到计数区观察并计数;调整细胞浓度为1×104个/ml接种于6个96孔培养板(编号1-6),每个96孔板选取4排(编号A、B、C、D)每排5个复孔,每孔加入100 ul细胞悬液;培养1 d,倒置显微镜观察细胞贴壁后,吸去A、B、C、D各排复孔内旧培养液,分别加入pH5.5,6.5,7.5,8.5培养液,再额外设置5个复孔分别加入pH 5.5,6.5,7.5,8.5培养液作为空白对照孔,用于校正不同颜色培养基对光密度(optical density, OD)值的影响。每天同一时刻取一个96孔板(防止检测吸光度时污染其他孔),每孔细胞加入CCK8试剂,继续孵育4 h。在酶联免疫检测仪上选择450 nm的波长,测定各孔吸收值,记录结果,以培养时间为横轴,OD平均值为纵轴绘制MDPC-23细胞生长曲线。

2 结果

2.1 不同pH龋洞微环境的模拟构建

成功配制了4组不同pH的培养液,pH值分别为5.5,6.5,7.5,8.5。其中,pH7.5接近普通DMEM培养液(含10%胎牛血清,pH约为7.7)的初始酸碱度被选为对照组。不同组培养液在多个时间节点重复测量,pH值稳定;24,48 h后分别测量样本的pH值,同一组的pH没有明显变化,极差不超过0.5。由于DMEM培养基含有酸碱指示剂,因而不同pH的培养液,呈现不同的颜色:pH为5.5时,酸性DMEM培养液呈现浅黄色;pH为6.5时,DMEM培养液呈现浅粉色,pH为7.5时,DMEM培养液呈现浅紫色,继续调整培养液pH值至8.5,碱性DMEM培养液则呈现深紫色(见图1)。

图1 不同pH的DMEM培养液颜色变化趋势Figure 1 Color changes of DMEM medium with different pH values

2.2 不同pH环境MDPC-23形态观察

不同pH培养液培养48 h后,MDPC-23细胞形态、生长情况呈现不同特点。pH 5.5环境下,细胞形态与对照组(pH 7.5)差异明显,由对照组的短梭形或三角形变异为长梭形,部分细胞形态完整性破坏,细胞数量少且呈现轻度聚集生长趋势(见图2A);pH 6.5环境下,细胞形态与对照组相比有轻度变化,近似梭形,相同放大倍率视野下细胞数量较少,表现出一定的聚集倾向(见图2B);pH 7.5环境下,细胞形态基本恒定,细胞呈短梭形或三角形;细胞聚集生长,可形成细胞结节。显微镜视野下细胞较密集,聚集生长趋势明显(见图2C);pH 8.5环境下,与对照组(pH 7.5)相比,相同放大倍率的显微镜视野下,细胞数分布更为密集,聚集生长现象明显,胞体较小。多个细胞聚集在一起,可形成细胞结节形态。部分细胞一端有细长突起,细胞形态不规则(见图2D)。

图2 分别以pH5.5,6.5,7.5和8.5培养液培养48 h后细胞形态Figure 2 The morphology of MDPC-23 cells cultured in pH 5.5,6.5, 7.5 and 8.5 for 48 h

2.3 不同pH微环境下细胞生长曲线

pH 5.5环境下,光密度值(optical density, OD)并未随着培养时间的增加而升高,4 d后OD值开始降低,表示加入pH 5.5培养液后,细胞数量基本没有增加,增殖受到抑制。pH 6.5环境下,细胞增长大致呈“S”型,在培养3 d后OD值达到最大值,细胞生长进入平台期;pH 7.5环境下,细胞增殖呈现较为典型的“S”型,在培养3 d后达到峰值,细胞生长进入平台期;pH 8.5环境下,细胞增殖呈现典型的“S”型,但4 d后达到平台期,晚于pH 7.5和pH 6.5;pH 8.5培养液组OD值峰值高于pH 6.5组和pH 7.5组(见图3)。

图3 不同pH环境下MDPC-23生长曲线Figure 3 The growth curve of MDPC-23 cultured in different pH environment

3 讨论

实验结果显示,永生化小鼠成牙本质细胞系MDPC-23在不同的pH微环境中,呈现出不同的形态特征,由此可以判断pH微环境对成牙本质细胞的生理功能具有一定的影响。采用不同pH值的培养液培养MDPC-23细胞48 h后,观察细胞形态,发现酸碱环境均会导致细胞形态发生变异,显微镜视野内细胞增长数量也有所差异;本实验也利用CCK8试剂检测不同pH环境下MDPC-23细胞的增殖活性,发现酸、碱性环境均对细胞增殖活性产生影响。pH 5.5组在培养4 d后显示出抑制细胞增殖活性的作用,说明龋洞内可能会产生超出细胞耐受阈值的酸性环境,对成牙本质细胞增殖有较为明显的负向影响;相对于pH 7.5和pH 8.5组的细胞增殖情况,pH 6.5组在各个时间点的细胞数量均低于这两组,提示弱酸微环境对细胞有持续的轻度抑制作用。此外,成牙本质细胞在pH8.5碱性环境培养初期受到抑制,后期则显示出较好的耐受性。

龋坏引起成牙本质细胞暴露于外界刺激,导致成牙本质细胞生活的微环境由稳定的牙本质小管环境变为易受外界干扰的不稳定环境,其中,细胞生活微环境pH的变化是龋坏引起的变化因素之一。通过对不同pH培养液环境下MDPC-23形态观察,可以初步认为pH微环境对成牙本质细胞形态、增殖状态具有一定的影响。pH 5.5的环境对细胞有明显的细胞增殖毒性,在加入pH 5.5培养液4 d后OD值开始降低,说明细胞在pH 5.5的环境中增殖活性受到抑制在pH 6.5和pH 7.5的培养液中,细胞增殖在第3 d达到平台期,但pH 6.5组测得的OD值峰值低于pH 7.5组,说明相比于pH 7.5的环境,在pH 6.5时,细胞的增殖有所下降。pH 8.5的碱性环境中,OD值开始的前3 d小于pH 6.5和pH 7.5组,在第4天达到峰值,且峰值大于pH 6.5和pH 7.5两组的OD值,说明细胞在碱性环境下的增殖活性在前期受到抑制,后期对碱性环境则有较好的耐受性。因此,酸性的环境具有细胞增殖抑制作用,龋坏患牙由于产酸细菌代谢作用导致的洞腔低pH微环境可能是引起成牙本质细胞生理代谢发生改变的因素之一[10]。

综上所述,在不同pH微环境下,永生化小鼠成牙本质细胞系MDPC-23的增殖能力和形态特征均有所差异,且可以初步认为pH微环境是造成这些差异的最主要原因。然而,造成这一差异的机制尚不完全明确。有研究认为pH可能通过酸敏感离子通道ASICs、细胞膜Ca2+通道或TREK-1 K+离子通道影响细胞活性[11]。此外,研究表明成牙本质细胞具有初级纤毛细胞器结构,与高尔基复合体联系密切,推测也可能具有细胞定向功能或定向分泌高尔基复合体分子的作用,为成牙本质细胞响应外界刺激、调控修复性牙本质的形成提供了结构基础[12-14]。本研究初步明确pH能够影响成牙本质细胞的增殖活性,今后尚需进一步研究以阐明pH调控成牙本质细胞生理活动的具体机制。