游泳运动对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的神经保护作用

熊 兰，卢元明

(四川省广元市第一人民医院神经内科，广元 628000)

多发性硬化症是一种免疫介导的中枢神经系统疾病。多发性硬化引起炎症，轴突脱髓鞘和中枢神经系统内神经退行性病变。多发性硬化症病理生理机制复杂，炎症和轴突脱髓鞘可能起重要致病作用[1]。在多发性硬化动物模型中，抑制促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin,IL-1β)和IL-6与疾病严重程度降低有关[2]。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是研究多发性硬化症最常用的动物模型之一。定期运动可通过增强抗原特异性免疫反应来抑制致病性感染[3]。其中游泳运动可提高肌肉耐力，促进抗炎作用，并具有神经保护作用[4]。与跑步运动相比，游泳运动可以提高适应能力，产生更多的神经保护作用[5]。但是游泳运动对EAE患者神经保护作用仍不明确。因而，本研究旨在评估游泳运动对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG)诱导EAE大鼠的神经保护作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

雄性8-10周龄SD大鼠，体质量(210±5)g，购于西南医科大学实验动物中心。所有大鼠自由饮水和进食。动物实验遵照实验动物伦理和福利(动物伦理编号:2019DW113)严格执行。将SD大鼠随机分成4组：对照组、EAE组、EAE+游泳运动组和EAE+β-干扰素组，每组各10只大鼠。

1.2 实验仪器和试剂

冷冻切片机(德国莱卡公司)；MOG(美国Sigma公司)；卢克索固蓝(美国Sigma公司)；β-干扰素(上海恒远生物科技有限公司)；TUNEL试剂盒(瑞士罗氏公司)；髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、蛋白脂质蛋白(proteolipid protein,PLP)和神经生长因子(nerve growth factor,NGF)抗体(美国Santa公司)。

1.3 方法

1.3.1 EAE模型制备及干预方法 如前所述，将50 μg纯化MOG33-55溶解在200 μl生理盐水中，用弗氏完全佐剂(结核杆菌)使其均匀化(1 ∶1)，MOG33-55经尾基部皮内注射[6]。对照组在相同时间注射生理盐水。从EAE造模成功后5 d，游泳运动组大鼠游泳30 min，每天一次，连续26 d。EAE造模成功后5 d，β-干扰素组大鼠腹腔注射30万U的β-干扰素，每天一次，为期26 d(与游泳运动计划相同)。

1.3.2 神经功能评分 EAE造模成功后监测各组大鼠神经功能评分，每2 d一次，持续30 d(14次，不包括EAE诱导前一次预测试)。神经功能评分如下：0分为无临床体征，1分为尾瘫(或尾音丧失)，2分为尾瘫和后肢无力，3分为完全后肢无力，4分为完全后肢和前肢无力[6]。

1.3.3 旋转试验分析运动功能 将大鼠置于旋转装置中的旋转杆(直径为7 cm，固定速度为30 r/min)上单独隔间中。用磁跳板自动记录跌倒潜伏期。为了消除压力和疲劳，我们将大鼠潜伏期限制在300 s内。

1.3.4 握力试验分析肌力 将大鼠放置在一根悬空(高度为50 cm)钢条(直径为0.15 cm)上，大鼠会用四只爪子抓紧钢条，记录大鼠由放置到掉下来的时间。测试3次，取其平均值。

1.3.5 脱髓鞘评分 在EAE诱导后31 d处死大鼠。心脏灌注大鼠后取腰段脊髓切取20 μm冠状切片。将腰椎脊髓切片贴于明胶涂层玻片上。将载玻片脱水并与0.1%卢克索固蓝在95%乙醇和冰醋酸中孵育过夜(56 ℃)。玻片在0.1%碳酸锂和70%乙醇中依次分化。连接到光学显微镜上计算机辅助图像分析系统，分析每张玻片上4个区域是否存在脊髓脱髓鞘。脱髓鞘评分定义如下：0分表示正常，1分表示1个小局灶性脱髓鞘区域，2分表示2个或3个脱髓鞘区域，3分表示1-2个大的脱髓鞘区域，4分表示广泛脱髓鞘，涉及超过20%白质[7]。

1.3.6 ELISA分析促炎细胞因子 按照ELISA试剂盒规定的步骤，检测各组大鼠腰段脊髓组织中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子浓度。

1.3.7 Western blotting分析MB、PLP和NGF 提取各组大鼠腰段脊髓，按10 ml/g比例加入全细胞裂解液，匀浆、超声破碎，BCA法进行蛋白定量，制备成电泳样品。取30 μg进行SDS-PAGE电泳，然后转至PVDF膜上。经5%牛奶孵育1 h。分别用兔源MBP(1 ∶1 000)、PLP(1 ∶1 000)和NGF(1 ∶1 000)4 ℃孵育3 h。用山羊抗兔二抗(1 ∶10 000)，室温孵育1 h。采用Quantity one图像分析软件对目标条带吸光度积值进行分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，然后进行Tukey’s检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 游泳运动对大鼠神经功能评分影响

EAE诱导后9 d出现尾瘫或后肢无力，神经功能评分显著增加，直至诱导后21 d(均P<0.01，见图1)。游泳运动改善了EAE症状，使神经功能评分显著降低(均P<0.01，见图1)。游泳运动组和β-干扰素组大鼠神经功能评分无统计学差异。

2.2 游泳运动对大鼠运动功能和肌力影响

试验结果显示，与对照组相比，EAE组跌倒潜伏期和握力降低(均P<0.05)；与EAE组相比，EAE+游泳运动组和EAE+β干扰素组跌倒潜伏期和握力均增加(均P<0.05，见图2，3)，但EAE+游泳运动组和EAE+β-干扰素组大鼠潜伏期和握力无统计学差异。

与对照组比较，*P<0.05；与EAE组比较，#P<0.05图1 游泳运动对大鼠神经功能影响Figure 1 Effect of swimming on neural function in rats

2.3 游泳运动对大鼠促炎细胞因子表达影响

与对照组相比，EAE组大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6表达增加(均P<0.05)；与EAE组相比，EAE+游泳运动组和EAE+β干扰素组大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6表达降低(均P<0.05，见表1)，但游泳运动组和β-干扰素组大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6表达无统计学差异。

与对照组比较，*P<0.05；与EAE组比较，#P<0.05图2 游泳运动对大鼠跌倒潜伏期影响 (n=10)Figure 2 Effect of swimming on fall latency in rats (n=10)

表1 游泳运动对大鼠促炎细胞因子影响Table 1 Effect of swimming on proinflammatory cytokines in rats

2.4 游泳运动对大鼠脱髓鞘评分影响

与对照组相比，EAE组大鼠脱髓鞘评分升高(P<0.05)。与EAE组相比，EAE+游泳运动组和EAE+β干扰素组大鼠脱髓鞘评分显著降低(均P<0.05，见图4)，但游泳运动组和β-干扰素组大鼠脱髓鞘评分无统计学差异。

2.5 游泳运动对大鼠NGF、MBP和PLP表达影响

Western blot结果显示，与对照组相比，EAE组大鼠腰髓NGF、MBP和PLP表达降低(均P<0.05)。与EAE组相比，EAE+游泳运动组和EAE+β干扰素组大鼠NGF、MBP和PLP表达增加(均P<0.05，见图5和表2)，但游泳运动组和β干扰素组大鼠NGF、MBP和PLP表达无统计学差异。

表2 游泳运动对大鼠NGF、MBP和PLP表达比较Table 2 Effects of swimming on the expression of NGF, MBP and PLP in rats

3 讨论

本研究结果显示，大鼠注射MOG33-55可增加神经功能评分，降低运动协调和肌力。我们的研究结果与之前的研究结果相同，显示MOG33-55增加了神经功能评分和运动功能障碍[8]。EAE诱导通过增加促炎性细胞因子和炎性渗出物水平促进轴突损伤[9]。在本研究中，腰椎脊髓部位促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)增加可能归因于EAE诱导。本研究结果也表明，EAE症状会因促炎性细胞因子过度产生而恶化。规律体育锻炼可减少神经元变性和炎症[9]。特别是慢性体育锻炼可能会进一步影响先天免疫系统各种细胞数量，包括中性粒细胞、单核细胞和自然杀伤细胞[10]。另外还有研究表明，淋巴细胞在运动期间和运动后增加，影响T细胞和B细胞，并调节促炎和抗炎细胞因子平衡[10]。在本研究中，我们发现游泳运动显著抑制促炎细胞因子产生，其程度与β-干扰素治疗相同。游泳运动在EAE诱导10 d后促进单核细胞浸润并减少促炎环境，减轻啮齿动物EAE症状严重程度[11]。我们的实验结果显示，游泳运动抑制促炎细胞因子产生。多发性硬化患者脑内MBP自催化作用增强可能有助于免疫显性表位产生。MBP降低表明多发性硬化症脱髓鞘状态[12]。同样，PLP在髓鞘致密、稳定和维持，以及少突胶质细胞发育和轴突存活中发挥作用，因此，EAE中PLP减少表明脱髓鞘[13]。NGF可通过髓鞘生物合成促进中枢神经系统健康。脑NGF增加可能有助于抑制EAE啮齿类动物神经丢失，并减弱疾病进展[14]。在本研究结果中，注射MOG33-55后，MBP、PLP和NGF表达降低，表明EAE诱导脱髓鞘。最终，MBP、PLP和NGF表达降低增加了腰椎脊髓区域脱髓鞘评分。体育运动通过平衡辅助性T细胞-1和辅助性T细胞-2来调节免疫[15]，从而减少EAE脱髓鞘和炎症反应。运动调节免疫反应成分，减少自体反应细胞穿过血脑屏障进入腰脊髓运动[16]。在本研究中，我们发现在MOG33-55诱导EAE大鼠中，游泳运动增加了MBP、PLP和NGF表达。此外，游泳运动降低了腰椎脊髓区域脱髓鞘评分。

与对照组比较，*P<0.05；与EAE组比较，#P<0.05图4 游泳运动对大鼠脱髓鞘评分影响 (n=10)Figure 4 Effect of swimming on demyelination score in rats (n=10)

1.对照组;2.EAE组;3.EAE+游泳运动组;4.EAE+β干扰素组图5 游泳运动对大鼠NGF、MBP和PLP表达影响Figure 5 Effect of swimming on NGF, MBP and PLP in each group by immunoblotting

总之，本研究结果表明，游泳运动可能通过调节腰髓NGF、MBP和PLP蛋白表达抑制MOG33-55诱导的EAE大鼠炎症和脱髓鞘，改善运动功能和临床损害。