富含γ-氨基丁酸的黑苦荞发芽的条件优化及成分分析

黄思苑，罗嘉源，叶俊锋，任运红，张雅甄，杜 冰,2, ，黎 攀,

（1.华南农业大学食品学院, 广东广州510642；2.云南省杜冰专家工作站, 云南普洱665008）

苦荞作为一种天然功能食品，兼具“营养、保健、医疗”的作用。黑苦荞是苦荞的一种，因含有黄酮、多酚、芦丁、槲皮素等多种生物活性成分而具备独特的保健功效[1-2]。现代药理研究成果表明，黑苦荞具有降血压[3]、降血脂[4]和降血糖[5]的“三降效果”，以及抗氧化[6]、抗肿瘤[7]、抗炎[8]等多种功能作用。γ-氨基丁酸（GABA）作为黑苦荞中常见活性物质，具有镇静和减轻兴奋[9]、调节血压和改善大脑功能[10]。此外，GABA可以刺激胰岛素的释放，有效预防II型糖尿病[11]，还能促进酒精代谢和抑制癌细胞增殖[12]。虽然GABA有许多重要的生理功能，但人体内的GABA含量会因为年龄和外界压力的增加而逐渐减少[13]，因此开发富含GABA的功能性食品意义重大[14]。

发芽是一种廉价而有效的加工技术，可以提高谷类和豆类的营养品质。苦荞萌发过程可以改善苦荞籽粒的活力，提高相关酶活力及生物活性成分的含量，尤其可以积累GABA等营养物质[15]。同时，发芽会降低黑苦荞中的蛋白酶抑制剂的活性，能够提高苦荞蛋白质中氨基酸的利用率[16]。据报道，谷物GABA含量与浸泡和发芽的温度和时间息息相关[17]。目前，关于提高GABA产量的研究主要集中在糙米、大豆、燕麦等粮食作物中[2]，有关黑苦荞GABA的最佳富集工艺鲜有研究。

因此，本研究采用单因素实验结合响应面法探索发芽黑苦荞中GABA富集的最佳工艺条件，进一步提高黑苦荞的营养价值和保健功能，为发芽富集GABA提供理论依据，并为发芽黑苦荞精准化营养产品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑苦荞种子 由咀香园健康食品（中山）有限公司（中国广东省）提供；表儿茶素、γ-氨基丁酸 标准品，Sigma公司；没食子酸 国药集团化学试剂有限公司；芦丁标准品、槲皮素标准品 上海源叶生物科技有限公司；绿原酸标准品 北京普天同创生物科技有限公司；山奈酚标准品 中国食品药品检定研究所；无水乙醚、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂、亚甲基蓝指示剂、氢氧化钠、95%乙醇、三氯化铝、乙酸钾、甲醇、盐酸、次氯酸钠等 分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

UV759紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；FA2004A分析天平 上海精天电子仪器厂；HH-4数显恒温水浴锅 常州市华普达数学仪器有限公司；DHP-600电热恒温培养箱 京市永光明医疗仪器厂；LC-20AT高效液相色谱仪 日本岛津公司；HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 色谱柱，美国安捷伦公司；DGG-9070B鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；ANKE TDL-5-A离心机 上海安亭分析仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 黑苦荞种子浸入5%的NaClO溶液中消毒15 min，然后用蒸馏水洗涤5次，之后在15～40 ℃的蒸馏水中浸泡2～12 h。将种子置于具有2层滤纸的培养皿中，再覆盖3层湿润的纱布，放入恒温培养箱中，在15～40 ℃和80%相对湿度的恒温培养箱中放置2～7 d，以获得发芽的黑苦荞，在发芽过程中，每6 h更换一次纱布以保持苦荞湿润。制备好的发芽黑苦荞种子与未经过发芽处理的黑苦荞种子都放在-80 ℃的冰箱中冷冻24 h以后，转移至真空冷冻干燥器中，干燥48 h后，用粉碎机磨碎，60目过筛，即得到发芽前后的黑苦荞样品。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 发芽天数对发芽黑苦荞GABA含量的影响按照1.2.1所述方法处理黑苦荞。发芽温度为25 ℃、浸泡时间6 h、浸泡温度为25 ℃、相对湿度为 85%，发芽时间分别为 1、2、3、4、5、6 d，测定发芽后苦荞GABA的含量。

1.2.2.2 发芽温度对发芽黑苦荞GABA含量的影响按照1.2.1所述方法处理黑苦荞。发芽时间为4 d、浸泡时间6 h、浸泡温度为25 ℃、相对湿度为85%，发芽温度分别为 15、20、25、30、35、40 ℃，测定发芽后苦荞GABA的含量。

大多学者认为，负面清单模式可以视为私法自治在行政法领域的延伸。[13]虽然我们认可私法自治对个人权利和自由的尊崇，但私法自治仍存有一定的边界，即不能损害公共利益和公序良俗，不能违反法律的强制性规定和禁止性规定，否则将受到法律的制裁。此外，市场经济中市场主体逐利的边际效用与成本是对市场主体行为的内在约束，网约车与负面清单模式在经济目标、法律效果上同样存在边界的吻合。

1.2.2.3 浸泡时间对发芽黑苦荞GABA含量的影响按照1.2.1所述方法处理黑苦荞。发芽温度为25 ℃、发芽时间为4 d、浸泡温度为25 ℃、相对湿度为 85%，浸泡时间分别为 2、4、6、8、10、12、14 h，测定发芽后苦荞GABA的含量。

1.2.2.4 浸泡温度对发芽黑苦荞GABA含量的影响按照1.2.1所述方法处理黑苦荞。发芽温度为25 ℃、发芽时间为4 d、浸泡时间6 h、相对湿度为85%，浸泡温度分别为 15、20、25、30、35、40 ℃，测定发芽后苦荞GABA的含量。

1.2.3 响应面优化试验 在单因素实验的基础上，按照Box-Behnken试验设计方案，以GABA含量为响应值，进行3因素3水平的响应面实验设计，通过Design Expert 11软件对实验数据进行分析，并预测富集GABA的最佳工艺条件。实验因素及水平如表1所示。

表1 Box-Behnken实验因素及水平Table 1 Box Behnken experimental factors and levels

1.2.4 GABA含量的测定 GABA含量的测定参照NY/T 2890-2016所述的高效液相色谱法进行测定。检测波长 436 nm；柱温 40 ℃；进样量 10 μL；流动相A为乙腈，流动相B为质量浓度为6.8 g/L的三水合乙酸钠溶液；流速1.0 mL/min。GABA标准曲线方程为：Y=113.8X+170.28，R2=0.994。

1.2.5 基本成分的测定 水分测定方法按照GB 5009.3-2016食品中水分测定中所述的直接干燥法进行测定；灰分和脂肪测定分别按照国标GB 5009.4-2016和GB 5009.6-2016中所示的方法进行测定；蛋白质测定按照GB 5009.5-2016食品中蛋白质的测定所示的凯氏定氮法进行测定；碳水化合物的含量通过计算得到，具体计算方式为碳水化合物（g/100 g）=100-（蛋白质+脂肪+水分+灰分）。

1.2.6 生物活性成分测定 样品中的总黄酮含量按照NY/T 1295-2007荞麦及制品中总黄酮含量的测定进行测定。采用汪建飞[9]所述的福林酚法测定每个样品的总酚含量，总酚含量用没食子酸当量表示。芦丁、槲皮素、山奈酚和表儿茶素的检测方法如下：芦丁含量的测定方法参照《保健食品功效成分检测方法》中所示的芦丁的高效液相色谱测定法进行测定；槲皮素和山奈素依照《中国药典》中所示的方法进行测定；表儿茶素的测定根据Jiang等[18]所述的方法进行测定，样品经70%甲醇提取后，用高效液相色谱测定法进行测定。

1.3 数据处理

所有实验均为平行测定3次取平均值，采用Design Expert 11软件进行响应面试验设计与分析，数据用SPSS 25.0174软件进行显著性分析，P＜0.05，表示差异显著，P＜0.01，表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

图1 不同发芽时间对黑苦荞GABA含量的影响Fig.1 Effect of different germination days on GABA content of black tartary buckwheat

2.1.2 发芽温度对黑苦荞中GABA含量的影响 由图2可知，发芽黑苦荞中GABA含量随着发芽温度而呈现先上升后下降的趋势，在15～25 ℃，苦荞内GABA含量逐渐增加，直至25 ℃达到最高，为33.30 mg/100 g，在高于 25 ℃后，GABA含量开始下降。可能原因是温度偏高或偏低都会影响谷氨酸脱羧酶的空间结构及其与底物的亲和力，从而引起谷氨酸脱羧酶活性下降[12]，因此，最佳发芽温度为25 ℃。

图2 不同发芽温度对黑苦荞GABA含量的影响Fig.2 Effect of different germination temperature on GABA content of black tartary buckwheat

2.1.3 浸泡时间对黑苦荞中GABA含量的影响 由图3可知，发芽黑苦荞中GABA含量随着浸泡时间的延长呈现先增加后减少再增加的趋势，在浸泡时间为6 h时GABA含量最高，为33.0 mg/100 g。在2～6 h，苦荞内GABA含量快速增加，直至6 h达到顶峰，在 6～8 h，GABA 含量大幅度下降，8～12 h后 GABA含量缓慢增加但低于峰值，12 h后GABA含量后缓慢下降，本研究结果与姜秀杰等[19]的实验结果一致。可能原因是黑苦荞浸泡过程中，GABA合成相关酶被激活，而吸水后，胚内干物质从凝胶状态转变为溶胶物质，胚乳中的干物质转化为可溶性物质，黑苦荞的物质代谢速率加快，有利于谷氨酸脱羧酶生成[20]。而在6～8 h，细胞吸水膨胀破裂，大量可溶性蛋白溶出，酶活性下降，生成GABA底物减少[13]。因此，最佳浸泡时间为6 h。

图3 不同浸泡时间对黑苦荞GABA含量的影响Fig.3 Effect of different soaking time on GABA content of black tartary buckwheat

2.1.4 浸泡温度对黑苦荞中GABA含量的影响 由图4可知，黑苦荞中GABA含量随着浸泡温度的升高而呈现先增加后减少的趋势。在浸泡温度为25 ℃时，黑苦荞中的GABA含量最高，为33.40 mg/100 g。说明适当提高浸泡温度，有利于提高黑苦荞GABA的含量。当浸泡温度过高时，GABA的含量反而出现下降趋势。本实验结果和梅婵等[21]的实验结果一致，出现这种现象的原因可能是温度会影响谷物的吸涨速度，也会影响与富集GABA有关酶的活性。在一定温度范围内，温度越高，黑苦荞的吸水速度越快，胚乳中大分子物质在酶的作用下分解为小分子物质的量越多，为GABA的生成提供了充足的物质基础[13]。当浸泡温度过高时，吸涨速度多快，当吸水饱和后，会导致细胞结构破坏，从而导致谷氨酸等水溶性物质损失[14]。

图4 不同浸泡温度对黑苦荞GABA含量的影响Fig.4 Effect of different soaking temperature on GABA content of black tartary buckwheat

2.2 响应面试验结果与分析

单因素实验的结果表明，发芽温度对GABA含量的影响较小，为简化实验，减少实验次数，选择发芽天数、浸泡时间、浸泡温度3个因素，以GABA含量为指标进行响应面优化分析。

2.2.1 回归模型的建立及方差分析 在单因素实验的基础上，以发芽时间（A）、浸泡时间（B）、浸泡温度（C）为自变量，以GABA的含量为响应值（Y），实验方案和结果如表2所示。利用Design-Expert 11软件对响应面进行设计与分析，并建立回归模型，得出二元回归方程为：GABA （mg/100 g）=33.46-1.16A-0.6375B+1.73C+1.10AB-0.3750AC-1.03BC-3.46A2-2.75B2-3.33C2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

由表3 可知，模型F=95.13，P＜0.0001，说明模型达到了0.1%显著水平，并且R2=0.9919、R2adj=0.9815、R2pred=0.8921、失拟项P=0.0611＞0.05，说明模型预测性良好且失拟程度不显著，具有统计学意义。另外，各项显著性因素统计分析表明，其显著性大小顺序为浸泡温度＞发芽时间＞浸泡时间。

表3 响应面回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface regression model

2.2.2 响应面交互项分析 对表3数据进行二次多元回归拟合，得到二次回归方程的响应曲面见图5。GABA的含量随着各因素水平的增加呈现先上升后下降的趋势。

图5 各因素交互作用对黑苦荞 GABA富集量的影响Fig.5 Effects of interaction of various factors on GABA accumulation in black tartary buckwheat

2.2.3 最优条件的确定 根据响应面试验结果，得出回归模型对发芽黑苦荞中GABA富集量的最大预测值为33.829 mg/100 g，对应条件为发芽时间为3.801 d、浸泡温度26.266 ℃、浸泡时间为5.783 h，考虑到实际操作的可行性，将培养条件改进为：发芽时间4 d、浸泡时间6 h、浸泡温度25 ℃。对此条件进行验证实验，得到GABA含量为33.40 mg/100 g，验证值与理论值的相对误差较少，说明利用响应面法优化的条件对发芽黑苦荞富集GABA是可行的。

2.3 黑苦荞发芽前后的成分变化

为进一步探究发芽对黑苦荞成分的影响，测定在最佳发芽工艺条件下的发芽黑苦荞与未发芽黑苦荞的营养成分和活性成分的含量。

2.3.1 黑苦荞发芽前后营养成分变化 对发芽前后进行营养成分测定，结果见表4。发芽后，黑苦荞的灰分、粗蛋白质、粗脂肪的含量均有下降，而碳水化合物含量增加。王嘉怡等[22]的研究表明，糙米发芽后，灰分含量会显著下降，本研究与其结果一致，黑苦荞发芽后灰分含量下降可能是由于黑苦荞在萌发过程中会激活植酸酶，植酸酶分解植酸钙镁等物质后产生肌醇、磷酸钙盐和镁盐等可溶性的物质，从而在浸泡和发芽的过程中损失。黑苦荞的粗蛋白质含量在发芽后出现了小幅度的减少，可能是因为黑苦荞在发芽的过程中激活了蛋白酶，将蛋白质水解成了小分子的氨基酸和肽，从而导致粗蛋白质含量的下降[23]。黑苦荞发芽后，粗脂肪含量减少，一方面可能是与脂肪水解给种子功能有关[24]，另一方面可能是脂肪在发芽的过程中发生氧化反应，导致黑苦荞的粗脂肪含量在发芽后有所降低[25]。巢晓玲等[15]的研究表明，在种子萌发过程中，碳水化合物由于要提供能量，含量会下降，与本实验的结果相反，其原因可能是本研究中碳水化合物的含量（g/100 g）=100-（蛋白质+脂肪+水分+灰分），随着蛋白质、脂肪、灰分含量的减少，碳水化合物的含量会增加。

表4 黑苦荞发芽前后营养成分含量（g/100 g，以干基算）Table 4 Nutrient contents of black tartary buckwheat before and after germination (g/100 g, by dry basis)

2.3.2 黑苦荞发芽前后活性成分的变化 黄酮和多酚作为黑苦荞中的主要活性成分，由表5可知，发芽能显著提高黑苦荞中总酚、总黄酮、槲皮素、山奈素、表儿茶素、绿原酸含量。发芽后，总酚含量从1.43 g/100 g 增至 2.24 g/100 g（P＜0.01），总黄酮含量从 2.12 g/100 g 增至 2.75 g/100 g（P＜0.05），槲皮素含量从 0.06 g/100 g 增至 0.12 g/100 g（P＜0.05），山奈素含量从 3.98 mg/kg增至 7.42 mg/kg（P＜0.01），表儿茶素含量从4.58 mg/kg增至50.60 mg/kg（P＜0.001），绿原酸含量从9.48 mg/kg增至153.00 mg/kg（P＜0.001）。其中表儿茶素和绿原酸的增幅最大，分别是发芽前的11.05、16.14倍。总酚、总黄酮是黑苦荞中主要的活性成分，其含量和组成是影响苦荞种子功能和营养特性的重要因素。黑苦荞发芽后，总酚和总黄酮含量显著上升，可能的原因是苦荞种子发芽后苯丙氨酸解氨酶的活力会增加，合成了新的多酚类化合物[16]，促使发芽后总酚含量、总黄酮含量的提高，本研究结果与郑晨曦[17]的研究结果一致。黑苦荞发芽后芦丁含量下降，而槲皮素、山奈素、表儿茶素、绿原酸等黄酮类化合物含量上升，可能是因为在发芽过程中，黄酮类化合物发生系列生物转化，激活了体内的芦丁降解酶和苯丙氨酸解氨酶。一方面芦丁降解酶的激活导致芦丁分解合成了其他黄酮类化合物，另一方面苯丙氨酸解氨酶的活力增加导致多种黄酮类化合物的合成，因此芦丁含量显著下降，而槲皮素、山奈素等黄酮类化合物的含量显著上升[26]。黑苦荞发芽前后的活性成分含量对比，能有效说明发芽作为一种谷物制备的方法，可用于制备富含总酚、总黄酮、槲皮素、山奈素等生物活性成分的功能性食品。

表5 黑苦荞发芽前后活性成分含量（以干基算）Table 5 Contents of active components in black tartary buckwheat before and after germination (by dry basis)

3 结论

本研究采用单因素实验和响应面分析，得出了黑苦荞在发芽过程中影响其GABA含量的3个主要因素是发芽时间、浸泡时间和浸泡温度。响应面分析结果确定黑苦荞最优工艺条件为：发芽时间4 d、浸泡时间6 h、浸泡温度25 ℃。在此条件下发芽的黑苦荞GABA含量为33.40 mg/100 g。此外，本研究测定了发芽前后的黑苦荞基本营养成分和活性成分含量，结果表明，黑苦荞发芽后，灰分和芦丁含量显著下降，粗蛋白质和粗脂肪含量小幅度下降，而碳水化合物、总酚、总黄酮、槲皮素、山奈素、表儿茶素、绿原酸的含量明显上升。其中表儿茶素和绿原酸的增幅最大，分别是发芽前的11.05、16.14倍。本研究优化和确定了富含GABA黑苦荞的最佳发芽工艺，在此工艺下，不仅可以在较短的时间获得高水平的GABA产量，也可以显著提高黑苦荞中的生物活性成分的含量。本研究结果为进一步大规模生产富含GABA的黑苦荞新资源食品的开发提供了理论依据。