高效液相色谱法测定藜麦中齐墩果酸的含量

田建文,王彩艳,王 芳*,赵子丹

(1.宁夏农林科学院,银川 750002;2.农业农村部 枸杞产品质量监督检验测试中心,银川 750002)

藜麦是藜科藜属的一年生草本植物[1],含有丰富的蛋白质、膳食纤维、矿物质、氨基酸[2]、维生素等多种营养物质[3],被联合国粮食及农业组织认定是唯一满足人体基本营养需求的单体植物,并正式推荐为最适宜人类的“全营养食物”[4]。而藜麦中含有的皂苷成分是抗营养物质[5],通常以齐墩果酸、三萜类皂苷、商陆酸等形式存在[6-7]。其中,齐墩果酸具有护肝解毒、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫、降糖和利尿等生物活性功能[8-9]。

目前齐墩果酸的测定方法主要有紫外分光光度法[10]、液相色谱-串联质谱法[11]、薄层色谱扫描法[12]、香草醛高氯酸法等。藜麦的品种多样,其提取液呈现不同颜色,采用紫外分光光度法测定时,颜色干扰严重,导致结果不准确;液相色谱-串联质谱仪价格高,推广有一定局限性;薄层色谱扫描法显色斑点不清晰,难以得到满意的结果;香草醛高氯酸法测定过程复杂,分析效率较低,使用的高氯酸和乙酸具有强腐蚀性。因此,需要建立一种灵敏度高、准确度高的简单高效分析方法。本工作通过优化齐墩果酸的提取方法和色谱条件等,建立了高效液相色谱法测定藜麦中齐墩果酸含量的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

LC-20AD 型高效液相色谱系统,配紫外检测器和Lab Solutions色谱工作站;PL202-S 型电子天平;KQ5200DE型数控超声波清洗器;XMTD-4000型电热恒温水浴锅。

齐墩果酸标准储备溶液:1.000 g·L－1,称取齐墩果酸标准品10 mg(精确至0.00001 g),用10 mL甲醇溶解,配制成质量浓度为1.000 g·L－1的齐墩果酸标准储备溶液,于－18 ℃保存。

齐墩果酸标准溶液系列:移取适量的齐墩果酸标准储备溶液,用甲醇逐级稀释,配制成质量浓度为5,10,20,100,200,500 mg·L－1的齐墩果酸标准溶液系列,于－18 ℃保存。

齐墩果酸标准品的纯度不小于98%;藜麦样品采自宁夏固原地区;盐酸、乙酸铵、乙醇均为分析纯;甲醇为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

Agilent TC-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);柱温35℃;流量1.0 mL·min－1;进样量10μL;流动相为体积比85∶15 的甲醇-0.1 mol·L－1乙酸铵溶液的混合液;等度洗脱;检测波长215 nm。

1.3 试验方法

对藜麦样品进行脱壳处理,称取藜麦1.5 g于150 mL磨口锥形瓶中,加入甲醇40 mL和3 mol·L－1盐酸溶液10 mL,超声提取20 min,再回流水解1.5 h,所得提取液按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

试验选用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%(体积分数)乙酸溶液的混合液、乙腈-含0.5%(体积分数)乙酸铵的甲醇溶液的混合液、甲醇-0.1 mol·L－1乙酸铵溶液的混合液5 种不同流动相体系,以Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)为色谱柱时,经高效液相色谱分析,均可有效分离目标成分齐墩果酸。结合出峰时间、峰形、杂质的干扰等因素,试验最终选择甲醇-0.1 mol·L－1乙酸铵溶液混合液为流动相,并考察了甲醇和0.1 mol·L－1乙酸铵溶液的体积比分别为85∶15,90∶10,88∶12,80∶20时对齐墩果酸分离效果的影响。经对比分析,以体积比为85∶15的甲醇-0.1 mol·L－1乙酸铵溶液的混合液为流动相时,齐墩果酸分离效果较好。

2.2 提取方式的选择

齐墩果酸常用的提取方式有溶剂提取、超声辅助提取、微波辅助提取[13]。根据齐墩果酸可溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮和三氯甲烷等有机溶剂,不溶于水的特性[14],试验考察了超声、匀浆、振荡3种提取方式对齐墩果酸测定值的影响。结果表明,经上述3种方式提取后,杂质干扰严重,齐墩果酸不能很好地分离,进而影响其测定结果,无法得到准确的测定值。齐墩果酸通常以游离酸的形式存在,经水解可将其转化成苷元以排除杂质干扰,故考虑采用酸水解的方式提取齐墩果酸。

以甲醇-3 mol·L－1盐酸溶液的混合液为提取剂,考察了直接酸水解(直接酸水解1.5 h)和超声-酸水解(先超声提取20 min,再回流水解1.5 h)两种提取方式对齐墩果酸测定值的影响。结果表明,经上述两种方式提取后,齐墩果酸的测定值依次为2.54,2.99 g·kg－1;样品经超声-酸水解后,能有效排除杂质的干扰,同时对该提取方式进行加标回收试验,验证方法的可行性,回收率为99.2%。因此,试验选择超声-酸水解的方式来提取藜麦中的齐墩果酸。

2.3 提取剂的选择

试验采用超声-酸水解的提取方式,进一步考察了甲醇-盐酸溶液的混合液、乙醇-盐酸溶液的混合液两种提取剂对齐墩果酸测定值的影响。结果表明,经甲醇-盐酸溶液的混合液提取后,藜麦样品提取液中杂质少,齐墩果酸分离效果好,测定值为2.99 g·kg－1,提取率高;而经乙醇-盐酸混合液提取后,齐墩果酸的测定值在2.75 g·kg－1左右,提取率较低。因此,试验选择提取剂为甲醇-盐酸溶液的混合液。

2.4 正交试验

采用L9(34)正交试验进一步优化水解条件,考察了水解时间(A)、盐酸浓度(B)、甲醇体积分数(C)3个因素对齐墩果酸测定值的影响,每个因素选取3个水平,并添加空列来衡量试验的可靠程度,结果见表1,并对优化出的组合进行加标回收试验。

表1 正交试验结果Tab.1 Results of orthogonal test

表1 (续)

结果表明,空列的极差较小,说明试验设计合理。甲醇体积分数对齐墩果酸测定值的影响较大,其次是水解时间和盐酸浓度,得出最优试验组合为C3A1B2和C3A2B2。按试验方法对两种组合进行验证,所得齐墩果酸的测定值分别为1.38,1.61 g·kg－1,可知当甲醇体积分数为80%,盐酸浓度为3 mol·L－1,水解时间为1.5 h时,藜麦中齐墩果酸的测定值相对较高。综上分析,试验选择以含3 mol·L－1盐酸的80%甲醇溶液为提取剂,采用超声-酸水解1.5 h的方式提取藜麦中的齐墩果酸。对优化出的试验组合进行加标回收试验,所得平均回收率为98.6%。

2.5 标准曲线与检出限

按照试验方法对齐墩果酸标准溶液系列进行测定,以齐墩果酸的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明,齐墩果酸的质量浓度在5～500 mg·L－1内与其对应的峰面积呈线性关系,线性回归方程为y＝1.732×106x－6.272×103,相关系数为0.9994。

对0.02 mg·L－1齐墩果酸标准溶液进行测定,以3倍信噪比(S/N)作为检出限(3S/N),10倍信噪比作为测定下限(10S/N),计算得齐墩果酸的检出限为0.3 mg·kg－1,测定下限为1.0 mg·kg－1。

2.6 稳定性试验

按照试验方法,对放置0,2,4,6,8,12,24 h的藜麦样品提取液进行测定,计算齐墩果酸保留时间及峰面积的相对标准偏差(RSD)。结果表明,齐墩果酸保留时间的RSD 为0.23%,峰面积的RSD 为3.9%,说明藜麦样品提取液在24 h内稳定。

2.7 精密度和回收试验

按照试验方法,对藜麦样品进行低(50 mg·L－1)、中(100 mg·L－1)、高(200 mg·L－1)等3个浓度水平的加标回收试验,计算回收率和测定值的RSD,以验证方法的准确度和精密度,结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n＝5)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

结果显示,齐墩果酸的回收率为98.0%～101%,RSD 为4.2%～7.5%,表明该方法的准确度高、精密度好,满足分析要求。

2.8 样品分析

按照试验方法对12个藜麦样品进行测定,结果显示,12个藜麦样品中均检出齐墩果酸,检出量依次 为9.63,21.26,3.79,0.68,1.47,1.45,1.80,0.73,0.51,1.66,5.31,0.67 g·kg－1。

本工作以超声-酸水解的方式提取样品,建立了高效液相色谱法测定藜麦中齐墩果酸含量的方法。该方法简单、快速,重现性和稳定性好,避免了分光光度法颜色干扰问题及强腐蚀试剂的使用,提高了分析的准确性。