ABCG2、VEGF及miRNA-23a与乳腺癌术后同侧锁骨上淋巴结转移的关系

刘平贤 张浩 王征 李伟汉 陆佳团

作者单位：河南省南阳市中心医院乳腺分泌腺外科，河南，南阳473009

乳腺癌是临床上妇科常见的一种恶性肿瘤，具有高发病率、死亡率的特征。乳腺原位癌不致命，但若治疗不及时，易发生转移而侵袭心、脑、肺等重要器官，其中同侧锁骨上淋巴结转移是导致患者预后不良的因素之一［1-2］。临床相关报道显示，初诊伴有同侧锁骨上淋巴结转移总发病率较高，对女性生命健康造成严重危险［3］。外科根治术是目前临床治疗乳腺癌的主要方法，可有效切除肿瘤细胞，防止癌细胞扩散，但仍有部分患者因病情恶化而发生淋巴结转移，因此预测其淋巴结转移逐渐受到关注与重视［4］。近年来，相关研究发现，ATP 结合膜转运蛋白超家族G 成员2（ATP-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）及微小RNA-23a（miRNA-23a）等因子均与乳腺癌发生、发展及治疗、预后关系密切［5］，但关于其与乳腺癌术后同侧锁骨上淋巴结转移的关系报道鲜为少见。对此，本研究将探讨ABCG2、VEGF及miRNA-23a水平与乳腺癌术后同侧锁骨上淋巴结转移的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2018年6月至2020年10月收治的79 例乳腺癌行根治术患者纳为研究组。纳入指标：①所有患者均符合乳腺癌诊断标准［6］；②术前均未接受放化疗、抗氧化等治疗；③影像学资料和病理资料完整；④年龄＞18 岁，且无手术禁忌症。排除标准：①过敏体质；②合并血液、神经等系统疾病；③合并心、肝、肾等严重原发性疾病；④二次手术者。

79 例均为女性，平均年龄为（53.98±6.28）岁，伴同侧锁骨上淋巴结转移者43 例（转移组），未伴同侧锁骨上淋巴结转移者36 例（未转移组）。另选取同期进行健康体检的49 例健康女性作为对照组，平均（52.78±5.71）岁，各组资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院医学伦理委员会批准通过，受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 S-P 免疫组化染色法检测ABCG2、VEGF

主要试剂：兔抗人ABCG2 单克隆抗体、兔抗人VEGF 多克隆抗体、链酶菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（SP）试剂盒、胰蛋白酶及二氨基联苯氨酶底物显色试剂盒，均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

标本准备：手术切除的病理组织均经4%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm 连续切片后脱蜡、水化。使用S-P 免疫组化染色法对ABCG2、VEGF 蛋白进行检测，检测过程严格按照说明书进行。一抗阴性对照使用PBS（磷酸盐缓冲液）进行代替。

结果判断［7］：根据阳性细胞百分比、染色强度判定。阳性细胞百分比：0 分：无阳性细胞；1 分：阳性细胞＜10%；2 分：10%～50%；3 分：50%～75%；4 分：＞75%。染色强度：0 分，无色；1 分，淡黄色；2 分，棕黄色；3 分，棕褐色。总积分：上述2 项评分的乘积。阳性：总积分＞4 分。

1.2.2 荧光定量PCR 检测miRNA-23a

研究组于术前、对照组于体检当日空腹抽取受3 mL 外周静脉血，以4 000 r/min 离心10 min，分离血清，置于-20℃低温保存。根据总RNA 提取试剂说明书提取总RNA，水溶解后采用分光光度计测定RNA 浓度与纯度，吸光度在1.8～2.1 之间可用于后续逆转录。miRNA-23a 茎环逆转录反应引物：5′-CGTCGCTACATCcAG7AGCATATGCGACGCTrC-CAGT-3′。反应条件：42℃15 min，85℃5 s，4℃10 min。反应产物置于-20℃保存。应用SYBR Green rQ-PCR 试剂盒检测实时荧光定量PCR。miR-23a：上游引物（F）：5′-ITIHCAGA CCCCAGGCAG-GCACA-3′；下游引物（R）：5-TCCATCAGCGTCAA-CACCATCA-3′。本实验设置复孔3 个，采用u6基因作为内参，每个样品测定3 次，PCR 循环参数：95℃3 min；95℃12 s，62℃40 s，共40 个循环。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 22.0 进行分析，计量资料以（）表示，行t检验；计数资料以n（%）表示，行χ2检验；采用ROC 曲线分析ABCG2、VEGF及miRNA-23a 对乳腺癌术后同侧锁骨上淋巴结转移的预测价值，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组与研究组ABCG2、VEGF及miRNA-23a 表达情况比较

研究组ABCG2、VEGF 阳性表达率明显高于对照组，miRNA-23a水平明显低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 对照组与研究组ABCG2、VEGF及miRNA-23a 表达情况比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of ABCG2，VEGF and mirna-23a expression between control group and Study Group［n（%），（±s）］

表1 对照组与研究组ABCG2、VEGF及miRNA-23a 表达情况比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of ABCG2，VEGF and mirna-23a expression between control group and Study Group［n（%），（±s）］

组别研究组对照组t/χ2值P 值n 79 49 ABCG2阳性40（50.63）8（16.33）15.186＜0.001阴性39（49.37）41（83.67）VEGF阳性46（58.23）9（18.37）19.608＜0.001阴性33（41.77）40（81.63）miRNA-23a 1.32±0.13 2.44±0.21 37.303＜0.001

图1 免疫组化染色图（SP，×400）Figure 1 immunohistochemical staining（SP，×400）

2.2 转移组与未转移组ABCG2、VEGF及miRNA-23a 表达情况比较

转移组ABCG2、VEGF 阳性表达率明显高于未转移组，miRNA-23a水平明显低于未转移组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 转移组与未转移组ABCG2、VEGF及miRNA-23a表达情况比较［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of ABCG2，VEGF and mirna-23a expression between metastasis group and non metastasis group［n（%），（±s）］

表2 转移组与未转移组ABCG2、VEGF及miRNA-23a表达情况比较［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of ABCG2，VEGF and mirna-23a expression between metastasis group and non metastasis group［n（%），（±s）］

组别转移组未转移组t/χ2值P 值n 43 36 ABCG2阳性28（65.12）12（33.33）7.919 0.005阴性15（34.88）24（66.67）VEGF阳性36（83.72）10（27.78）25.213＜0.001阴性7（16.28）26（72.22）miRNA-23a 0.43±0.08 1.16±0.12 32.256＜0.001

2.3 不同临床病理参数乳腺癌患者ABCG2、VEGF及miRNA-23a 表达情况

不同年龄、肿瘤直径、月经状态及肿瘤类型的乳腺癌患者ABCG2、VEGF及miRNA-23a 表达比较差异无统计学意义（P＞0.05）。不同临床分期的患者VEGF 阳性表达率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。临床分期Ⅰ～Ⅱ期者ABCG2 阳性表达率显著低于Ⅲ期者，miRNA-23a水平高于Ⅲ期者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 ABCG2、VEGF及miRNA-23a与乳腺癌临床病理参数的关系［n（%），（±s）］Table 3 the relationship between ABCG2，VEGF and mirna-23a and clinicopathological parameters of breast cancer［n（%），（±s）］

表3 ABCG2、VEGF及miRNA-23a与乳腺癌临床病理参数的关系［n（%），（±s）］Table 3 the relationship between ABCG2，VEGF and mirna-23a and clinicopathological parameters of breast cancer［n（%），（±s）］

临床病理特征年龄（岁）肿瘤直径（cm）月经状态临床分期肿瘤类型≤50＞50≤3＞3绝经前绝经后Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ期浸润性导管癌浸润性小叶癌其他n 45 34 43 36 34 45 58 21 42 28 9 ABCG2 阳性21（52.50）19（47.50）18（45.00）22（55.00）17（42.50）23（57.50）20（50.00）20（50.00）21（52.50）14（35.00）5（12.50）χ2值0.658 2.905 0.010 22.768 0.098 P 值0.417 0.088 0.922＜0.001 0.952 VEGF 阳性25（54.35）21（45.65）23（50.00）23（50.00）22（47.83）24（52.17）36（78.26）10（21.74）26（56.52）16（34.78）4（8.70）χ2值0.307 0.871 1.030 1.324 0.950 P 值0.580 0.351 0.310 0.250 0.622 miRNA-23a 1.36±0.11 1.34±0.09 1.18±0.07 1.16±0.06 1.75±0.16 1.76±0.17 1.25±0.11 0.51±0.03 1.37±0.12 1.34±0.09 1.35±0.10 χ2值0.864 1.349 0.265 30.308 0.670 P 值0.391 0.181 0.791＜0.001 0.516

2.4 ABCG2、VEGF及miRNA-23a 对乳腺癌术后同侧锁骨上淋巴结转移的预测价值

ROC 曲线分析结果显示，ABCG2、VEGF及miRNA-23a 三者联合预测乳腺癌术后同侧锁骨上淋巴结转移的ROC 下曲线面积（AUC）为0.737，明显高于各项单独检测（P＜0.05）。见表4、图1。

图1 ROC 曲线Figure 1 ROC curve

表4 ABCG2、VEGF及miRNA-23a 对乳腺癌术后同侧锁骨上淋巴结转移的预测价值Table 4 the predictive value of ABCG2，VEGF and mirna-23a in ipsilateral supraclavicular lymph node metastasis after breast cancer surgery

3 讨论

对于乳腺癌患者而言，术后同侧锁骨上淋巴结转移的发生率较高，是乳腺癌预后不良的重要指标［8］。因此如何有效评估患者术后淋巴结转移是医学工作者关注的热点。

相关研究显示，ABCG2 是肿瘤细胞株中分离的ABC 转运蛋白家族之一，被认为与肿瘤耐药有关，尤其是在乳腺癌多药耐药中发挥重要作用［9］。Kim 等［10］研究发现，ABCG2 是参与肿瘤生长、分化、侵袭与转移等生物学行为的重要因子，且在乳腺癌中呈高表达。Kumari 等［11］研究则指出，ABCG2 过表达者，其生物学行为具有特殊性，表现为化疗效果差、患者预后不佳等。本研究发现，ABCG2 在乳腺癌中呈高表达，阳性率为50.63%，其与患者年龄、肿瘤直径等无明显关系，但与临床分期有关，且合并淋巴结转移者ABCG2 阳性表达率显著高于无淋巴结转移者。上述研究结果均提示ABCG2 在乳腺癌发生、转移过程中具有一定作用。

Kazakydasan 等［12］发现，乳腺癌侵袭与转移是一个涉及多方面因素的过程，其中肿瘤细胞的过度增殖及新生血管生成是重要影响因素。VEGF为作用于血管内皮细胞的血管内皮生长因子，是重要的血管生成正性调节因子，可促进血管内皮细胞分裂。肿瘤的生长依赖肿瘤新生血管的形成，血管生成对肿瘤的发生、侵袭和转移至关重要［13］。本研究中，转移组VEGF 阳性表达率显著高于无转移组，与国外研究结果相符［14］。提示VEGF 表达增高有利于乳腺癌细胞发生淋巴结转移。VEGF 可促进肿瘤血管内皮细胞增殖，增加肿瘤血管数量，为乳腺癌细胞转移提供通道。另外，本研究发现，VEGF 表达与肿瘤分期、病理类型均无关，与Choi 等［15］结果报道不符。推测可能与本研究样本量纳入偏少有关，亦可能与VEGF 的表达在不同类型肿瘤变异及发展过程中所起作用不明显有关。

miRNA-23a 是存在脊椎动物基因组中的一种抑癌因子，参与基因转录表达，具有调控细胞增殖的作用，其过表达可能可抑制肿瘤细胞的生长并促进肿瘤细胞凋亡，从而起到抑制肿瘤细胞增殖、侵袭的作用。本研究中，研究组miRNA-23a水平显著低于对照组，尤其是伴有淋巴结转移组miRNA-23a水平更低，且该因子表达与乳腺癌临床分期有关。周永安等［15］报道通过分析影响乳腺癌患者术后复发转移的危险因素亦发现，miRNA-23a低表达是患者术后复发转移的独立影响因素，与本研究报道相符。表明miRNA-23a 低表达可能提示患者伴有淋巴结转移，预后较差。此外，本研究ROC 曲线结果显示，ABCG2、VEGF及miRNA-23a 均可有效预测乳腺癌患者术后淋巴结转移，是评估患者术后淋巴结转移的重要指标，且联合检测的诊断价值最佳。

综上所述，ABCG2、VEGF表达增高，miRNA-23a表达下降对乳腺癌术后同侧锁骨上淋巴结转移有促进作用，推测上述因子可能是防止乳腺癌术后淋巴结转移的靶点。