减数分裂关键基因Spo11和Mlh1在鲫鲤杂交鱼中的遗传分析

朱辣 张美文 朱明 李琪 贺旺超 秦伟玲 周毅 杨聪慧 张纯 刘少军

摘要：【目的】明確鲫鲤杂交鱼减数分裂关键基因（Spo11和Mlh1）的序列和表达特征，揭示异源双亲减数分裂因子在杂交品系的传代中是否存在选择压力，为解析远缘杂交跨越生殖障碍打下遗传学基础。【方法】以已形成稳定品系的鲫鲤杂交鱼为研究对象，包括红鲫（RCC）、湘江野鲤（CC）、鲫鲤杂交子代（F1）和异源四倍体鲫鲤（4nAT），通过分子克隆、序列比对及Western blotting等方法研究Spo11基因和Mlh1基因在鲫鲤杂交鱼中的遗传规律和表达特征，并分析其与原始父母本间的关系。【结果】RCC、CC、F1和4nAT的Spo11基因CDS序列绝大部分为1152 bp，仅4nAT中存在1157 bp的CDS序列;在F1和4nAT中均稳定获得2种原始亲本的独立遗传片段，且在4nAT中还检测到原始父母本重组基因片段[4n-SPO11-11-2（MT648223）]，其与原始母本RCC-Spo11基因对应片段的相似性为96.2%，与原始父本CC-Spo11基因对应片段的相似性为93.7%，表明Spo11基因表达模式并非完全保守性及4nAT存在遗传变异性。Mlh1基因CDS序列在鲫鲤杂交鱼中同样稳定存在，表现出稳定的杂合遗传特征，即F1和4nAT中既存在RCC-Mlh1基因CDS序列（相似性为99.5%），也存在CC-Mlh1基因CDS序列（相似性为99.4%），鲫鲤杂交鱼相应的遗传片段和原始亲本间仅存在极少的基因位点变异。Western blotting检测结果表明，SPO11蛋白和MLH1蛋白在鲫鲤杂交子代中均能正常表达。其中，4nAT的精巢中仅表达相对分子量较大的SPO11-β亚体，而F1的精巢中仅表达相对分子量较小的SPO11-α亚体。【结论】F1和4nAT能稳定杂合遗传原始亲本RCC的Spo11基因和Mlh1基因，虽然在CDS序列结构上存在少量差异，但最终都能独立表达相关蛋白，即杂交鱼形成过程中减数分裂关键基因的表达正常可为其跨越生殖障碍打下分子基础。

关键词： 异源四倍体鲫鲤（4nAT）;Spo11基因;Mlh1基因;减数分裂;远缘杂交;遗传模式

中图分类号： S917                            文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）08-2251-08

Genetic analysis of key genes Spo11 and Mlh1 controlling meiosis in hybrid fish of Carassius auratus red var. （♀） × Cyprinus carpio L. （♂）

ZHU La， ZHANG Mei-wen， ZHU Ming， LI Qi， HE Wang-chao， QIN Wei-ling，

ZHOU Yi， YANG Cong-hui， ZHANG Chun*， LIU Shao-jun*

（State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish/Engineering Research Center of Polyploid Fish Reproduction and Breeding of Ministry of Education/College of Life Sciences， Hunan Normal University，

Changsha  410081， China）

Abstract：【Objective】The present study analyzed the characteristics of gene sequences and expression of key genes （Spo11 and Mlh1） in meiosis from the hybrid crucian carp（Carassius auratus red var.， ♀， abbreviated as RCC）×common carp（Cyprinus carpio L.， ♂， abbreviated as CC） ， which would reveal whether there was selection pressure for meiosis factors in hybrid lines， providing the genetic basis for understanding the mechanism of breaking through reproductive barriers in hybrid fishes. 【Method】In this study， the hybrid strains of RCC×CC which has formed stable strain was taken as research objects， containing RCC， CC， allodiploid hybrid of RCC（♀）×CC（♂） （abbreviated as F1） and allotetraploid hybrid of RCC（♀）×CC（♂）（abbreviated as 4nAT）， respectively. The genetic and expression characteristics of Spo11 gene and Mlh1 gene in hybrid crucian carp were studied by molecular cloning， sequence alignment and Western blot， and the gene-tic relationships among them and their original parents were analyzed. 【Result】Most of the CDS sequences of Spo11 gene in RCC， CC， F1 and 4nAT were 1152 bp， butsome1157bp CDS sequences were also found in 4nAT. Two independent genetic fragments of the original parents were stably obtained in F1 and 4nAT， and the recombinant gene fragment [4N-SPO11-11-2（MT648223）] of the original parents was also detected in 4nAT， and its similarity to the corresponding fragment of the RCC-SPO11 gene of the maternal was 96.2%， and to the corresponding fragment of the CC-Spo11 gene of the paternal was 93.7%， indicating that the expression pattern of Spo11 gene was not completely conserved and 4nAT possessed some genetic variations. CDS sequences of Mlh1 gene also were stably in hybrid crucian carp， showing stable heterozygous genetic characteristics， namely both CDS sequences of RCC-MLH1 gene（99.5%） and CC-MLH1 gene（99.4%） in F1 and 4nAT， and there were only a few gene loci variation in the corresponding genetic fragment between the original parents and hybrid fish. Furthermore， the results of western blotting showed that both SPO11protein and MLH1 protein expressed normally in the hybrid progeny of RCC（♀）×CC（♂）. The SPO11-β subunit with large molecular weight was only expressed in the testis of 4nAT， while SPO11-α subunit with small molecular weight was only expressed in testis of F1. 【Conclusion】These results show that F1 and 4nAT stabilize the Spo11 gene and Mlh1 gene of the heterozygous inherited original parental RCC， although there are small differences in CDS sequence structure， they can express related protein independently. It indicates that key meiotic genes are expressed normally during hybrid fish formation， and lay an important genetic basis for the analysis of the distant hybridization to overcome reproductive barriers.

Key words： allotetraploid crucian carp（4nAT）; Spo11 gene; Mlh1 gene; meiosis; distant crossing; genetic pattern

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31873038，31730098，U19A2040）; National Mo-dern Agriculture Industry Technology System Construction（CARS-45）

0 引言

【研究意义】异源四倍体鲫鲤（4n=200，简称4nAT）是世界上首次人工培育的两性可育异源四倍体鱼，以其为父本、日本白鲫为母本，可杂交形成三倍体湘云鲫（3n=150）（刘少军等，2000）。湘云鲫具有生长速度快、不育及肉质优等特点，已在我国28个省（市）大规模推广养殖，产生了显著的社会经济效益（颜金鹏等，2007）。4nAT源自红鲫（Carassius auratus red var. ♀）和鲤（Cyprinus carpio L. ♂）的远缘杂交，其F1代部分可育，自交获得的F2代部分能产生不减数的二倍体卵子和二倍体精子，从F3代中选育出4nAT。该四倍体鱼两性可育，且连续繁殖30余代，形成了遗传性状稳定的异源四倍体鱼群体（Liu et al.，2001）。在鱼类远缘杂交育种过程中，减数分裂关键基因的遗传与表达直接关系到杂交鱼生殖细胞能否越过减数分裂生殖障碍（Tao et al.，2008）。因此，在已越过生殖障碍的鲫鲤杂交鱼品系中，解析减数分裂关键基因在杂交子代和原始亲本间的遗传关系及表达情况，有助于揭示杂交鱼跨越生殖障碍的机理，进而有效指导鱼类远缘杂交育种。【前人研究进展】4nAT及相关鲫鲤杂交子代除了兼具原始父本和母本的特征条带外，还具备一些特异的非亲本特征条带（李建中等，2003，2005;刘季芳等，2007a，2007b;袁柳娇等，2020）。颜金鹏等（2005）对4nAT雌核发育后代及其亲本进行RAPD分析，结果发现子代G1与母本AT间的相似率为97%，远高于子代G1与父本SSC間的60%，说明异精激发产生的雌核发育后代G1的遗传物质与母本相同。Zhang等（2015）通过5S rDNA染色体原位杂交，发现鲫鲤杂交F1代及4nAT稳定遗传了等比例的原始亲本红鲫染色体组和鲤染色体组。但值得注意的是，4nAT存在重组基因片段，且较F1代具有更多的基因组变异（Wang et al.，2015;Ye et al.，2017a，2017b）。Liu等（2016）通过转录组测序发现，二倍体鲫鲤后代表现出父系偏向表达，而4nAT后代表现出母系偏向表达。在鲫鲤杂交鱼的等比例异源染色体组遗传模式中，源自不同原始亲本且存在稳定差异的减数分裂关键基因是否伴随染色体组稳定遗传，以及杂合遗传模式是否最终影响蛋白表达，均有待进一步探究。Spo11和Mlh1是减数分裂的关键基因，其基因功能正常发挥对于减数分裂过程中染色体行为的变化具有重要意义。其中，Spo11（Meiotic protein covalently bound to DSB homolog）为减数分裂特异性的拓扑异构酶，是减数分裂重组过程产生程序性DNA双链断裂（DNA double strand break，DSB）的直接效应蛋白（Robert et al.，2016;蒋涵玮等，2017;Lam et al.，2017）。目前，已在日本鳗鲡（Anguilla anguilla）（Ozakiy et al.，2006）、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus ）（尚婉婧等，2016）、斑马鱼（Danio rerio）（Pasquier et al.，2016;Zhang et al.，2020）及贵州草海鲫鱼（董然然等，2018）等硬骨鱼类中开展了Spo11基因的相关研究，并证实该基因在不同物种生殖细胞减数分裂过程中发挥重要作用，也说明Spo11的生物功能在不同物种中相对保守。Mlh1（Human mutL homolog 1）基因是减数分裂过程中错配修复的关键基因，其位点的出现在时间、数量和位置上与预期染色体交叉位点一致，已广泛应用于斑马鱼等脊椎动物的染色体重组和交叉研究（Feitsma et al.，2007），且其功能在不同物种中也非常保守。【本研究切入点】减数分裂是有性生殖物种世代交替的转折点，不仅维持基因组的稳定性，还通过重组创造遗传多样性，因此开展减数分裂关键基因克隆及其功能分析，对揭示减数分裂的分子机制具有重要意义。【拟解决的关键问题】以鲫鲤杂交品系中的亲代红鲫（RCC）、湘江野鲤（CC）、鲫鲤杂交子代（异源二倍体鲫鲤）F1和4nAT等4种鱼为研究对象，从cDNA序列水平研究Spo11基因和Mlh1基因在鲫鲤杂交鱼中的遗传规律和表达特征，并分析其与原始父母本间的关系，揭示异源双亲减数分裂因子在杂交品系的传代中是否存在选择压力，为解析远缘杂交跨越生殖障碍打下遗传学基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试的RCC、CC、F1和4nAT均由湖南师范大学省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室提供，取健康鱼体的精巢组织为试验材料。鱼体解剖前使用2-苯氧乙醇（美国Sigma公司）进行昏迷处理。

1. 2 基因编码区（CDS）序列克隆及比对分析

4种鱼均随机各取3尾，采集精巢组织提取总RNA。提取的总RNA采用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，28S rRNA和18S rRNA条带清晰即为合格的总RNA样品，然后以反转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（K1622，Thermo Scientific公司）反转录合成cDNA。从NCBI上检索并下载人类、小鼠、斑马鱼和鲤等物种Spo11基因和Mlh1基因的CDS序列，通过BioEdit v7.0.9.0比对合成相关的简并引物，以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系10.0 μL：cDNA模板1.0 μL，Mix（Taq）5.0 μL，正、反向引物各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃进行延伸（各对引物的特定退火温度和延伸时间见表1），进行32个循环;72 ℃终延伸10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切割目的片段进行胶回收纯化。将纯化后的目的基因片段克隆至pMD18-T载体上，菌液PCR鉴定呈阳性的重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，并利用BioEdit v7.0.9.0对测序结果进行同源比对分析。

1. 3 Western blotting检测

于每年4月（鱼类繁殖季节）收集4种供试鱼雄性个体的精巢组织，提取组织总蛋白，使用PierceTM BCA Protein Assay Kit（Cat. 23225，Pierce Chemical公司）提供的蛋白BCA法测定样本蛋白浓度，确保各样本上样量统一（30～50 μg），经SDS-PAGE电泳后，使用半干式转膜仪将蛋白转印至PVDF膜上，以5%脱脂牛奶进行封闭，加入1∶1000稀释的抗SPO11抗体（Abcam81695）或抗MLH1抗体（Abcam92312），4 ℃孵育过夜，1×PBST洗膜3次，加入1∶2000稀释的羊抗兔IgG（AS014，Abclonal公司），室温孵育1 h后以1×PBST洗膜3次，加入适量ECL发光液（A∶B=1∶1），然后置于暗室显影拍照。

2 结果与分析

2. 1 Spo11基因CDS序列克隆及测序分析结果

利用NCBI中的BLAST对测序分析获得的4种鱼Spo11基因CDS序列（表2）与已知斑马鱼Spo11基因CDS序列（NM_205682.1）进行同源比对分析，结果显示其相似性均高于86.4%。同时比对分析原始亲本（RCC和CC）与鲫鲤杂交鱼（F1和4nAT）的Spo11基因CDS序列，旨在了解鲫鲤杂交鱼Spo11基因CDS序列与原始亲本间的遗传关系，结果表明，RCC、CC、F1和4nAT的Spo11基因CDS序列绝大部分为1152 bp，仅4nAT中存在1157 bp的CDS序列（图1）。其中，RCC-Spo11基因和CC-Spo11基因间存在稳定的差异，其CDS序列相似性为95.8%～96.0%，但RCC-Spo11基因CDS序列和CC-Spo11基因CDS序列在鲫鲤杂交鱼中均稳定存在，即F1和4nAT中既存在RCC-Spo11基因CDS序列（相似性为98.6%～99.3%），也存在CC-Spo11基因CDS序列（相似性为98.9%～99.8%）。值得注意的是，在F1和4nAT中均稳定获得2种原始亲本的独立遗传片段，且在4nAT中还检测到原始父母本重组基因片段[4n-SPO11-11-2（MT648223）]，其与原始母本RCC-Spo11基因对应片段的相似性为96.2%，与原始父本CC-Spo11基因对应片段的相似性为93.7%。每尾鱼取可重复的代表性序列上传，Spo11基因CDS序列的同源比对分析结果详见表3。

2. 2 Mlh1基因CDS序列克隆及测序分析结果

Mlh1基因CDS序列相对稳定且保守。将所获得重复性高的代表性Mlh1基因CDS序列上传至NCBI Bankit获取相应序列号（表4）。在原始亲本（RCC和CC）中，能稳定克隆获得保守性非常高的Mlh1基因CDS序列，其中，RCC-Mlh1基因CDS序列为2175 bp，CC-Mlh1基因CDS序列为2172 bp。RCC-Mlh1基因CDS序列与CC-Mlh1基因CDS序列的最稳定差异在于CC较RCC在CDS序列的1076～1086 bp中段位置多出TAGTTCCTC碱基序列，且其3'端结尾序列也存在稳定差异，相似性仅为93.4%。此外，RCC-Mlh1基因CDS序列终止密码子是TAG，而CC-Mlh1基因CDS序列终止密码子为TGA。RCC-Mlh1基因CDS序列和CC-Mlh1基因CDS序列在鲫鲤杂交鱼中同样稳定存在，即鲫鲤杂交鱼（F1和4nAT）中既存在RCC-Mlh1基因CDS序列（相似性为99.5%），也存在CC-Mlh1基因CDS序列（相似性为99.4%），鲫鲤杂交鱼相应的遗传片段和原始亲本间仅存在极少的基因位点变异（图2）。Mlh1基因CDS序列的同源比对分析结果详见表5。

RCC和CC的Mlh1基因CDS序列分别编码724和723个氨基酸残基;F1和4nAT的RCC-Mlh1基因CDS序列均编码724个氨基酸残基，CC-Mlh1基因CDS序列均编码723个氨基酸残基。使用MegAlign对4种鱼的Mlh1氨基酸序列进行比对分析，结果如图3所示。由于CC-Mlh1基因CDS序列在1076～1086 bp中段位置存在TAGTTCCTC碱基序列，而在RCC-Mlh1基因CDS序列中不存在TAGTTCCTC碱基序列，说明该片段位点翻译表达出的蛋白序列也存在稳定差异，RCC为X--X，而CC为SSSS（图3中以红色框标识）。此外，RCC-Mlh1基因CDS序列结尾处的AAAAAGAAGAATAAAAAGGAATAG碱基序列与CC-Mlh1基因CDS序列结尾处的TTTGAAAG--AT GCTGA----------碱基序列也存在明显差异，其翻译表达出的蛋白序列在RCC中是TKKKNKKE，在CC中则为FEXXAX（图3中以黄色框标识）。可见，Mlh1基因表达在原始父母本中存在稳定差异，且这种差异在鲫鲤杂交鱼中稳定遗传。

2. 3 鲫鲤杂交鱼精巢SPO11和MLH1蛋白的表达分析结果

通过Western blotting检测4种鱼精巢SPO11蛋白和MLH1蛋白的表达情况，结果（图4）发现RCC、CC、F1和4nAT等4种鱼的精巢均能成功表达SPO11蛋白。已知SPO11蛋白存在2种剪接亚体形式（SPO11-α和SPO11-β）（蒋涵玮等，2017）。由图4可看出，RCC的精巢中同时表达2种蛋白亚体，且相对分子量较大的SPO11-β亚体表达量高于相对分子量较小的SPO11-α亚体;4nAT和CC的精巢中仅表达相对分子量较大的SPO11-β亚体（或同时表达极少量的SPO11-α亚体）;F1的精巢中仅表达相对分子量较小的SPO11-α亚体。此外，4种鱼的精巢均能成功表达出MLH1蛋白，且MLH1蛋白相對表达量在4种鱼间的差异较小，可能与所取精巢组织中含相关时期的初级精母细胞比例有关。

3 讨论

Spo11和Mlh1都是减数分裂的关键基因，在脊椎动物进化过程中相对较保守，其保障减数分裂正常进行的功能对物种延续具有重要意义。近年来，针对Spo11和Mlh1等关键基因在模式生物减数分裂过程中的调控机制越来越深入。Spo11在减数分裂的染色体重组后可使着丝粒解离（Hou et al.，2021），并协同切割产生DNA断裂（Johnson et al.，2021）;Mlh1关联信号通路调控减数分裂同源染色体交叉的产生（Cannavo et al.，2020）。至今，有关鱼类Spo11和Mlh1的研究主要是作为生殖细胞减数分裂发生的分子标记，通过克隆、组织定位及基因编辑等探究相关因子在鱼类中的进化关系和表达特征（尚婉婧等，2016;Zhang et al.，2020）。远缘杂交鱼需克服生殖障礙，其减数分裂关键基因能否正常表达是关键。因此，明确能越过生殖障碍的鲫鲤杂交鱼减数分裂关键基因遗传模式，有利于解析远缘杂交跨越减数分裂生殖障碍的遗传学基础，为鱼类遗传育种提供重要的理论指导。

本研究结果表明，Spo11基因和Mlh1基因在鲫鲤杂交子代中能正常转录及翻译出结构和功能正常的蛋白，说明这2种基因在鲫鲤杂交鱼中均能正常表达，由其控制的减数分裂重组和错配修复过程在远缘杂交鱼中均能表达出相关蛋白，对保证SDB的形成至关重要（Blokhina et al.，2019）。这也为杂交鱼生殖细胞最终能完成减数分裂及产生具有功能的配子奠定了重要基础。从CDS序列的遗传模式来看，Spo11基因和Mlh1基因均较保守，其共同特征是在杂交子代中稳定获得2种原始亲本的独立遗传片段。对于Spo11基因而言，F1和4nAT既拥有原始母本RCC-Spo11基因片段，也拥有原始父本CC-Spo11基因片段;对于Mlh1基因而言，F1和4nAT既拥有原始母本RCC-Mlh1基因片段，也拥有原始父本CC-Mlh1基因片段。整体上，二者均保持了杂交鱼遗传物质的异源稳定性，且4nAT是F1多倍化后繁殖30代以上的子代，仍保持这个杂合遗传的特性，与已报道杂交鱼在染色体组水平保持异源稳定性（Zhang et al.，2015）的结论一致。值得注意的是，在4nAT中发现重组型的Spo11基因遗传片段，与尚婉婧等（2016）研究报道Spo11基因表达模式并非完全保守的结论一致，也暗示4nAT较F1存在更多的变异性（Wang et al.，2015;Ye et al.，2017a，2017b）。说明这2个保守功能基因的稳定遗传在杂交多倍化过程中能和谐共处，进一步验证杂交多倍化后的异源稳定性特征。在历经30余代以后的4nAT中检测到Spo11基因的原始父母本重组基因片段[4n-SPO11-11-2（MT648233）]，表明异源多倍体的功能基因序列有交流和同化趋势，但具体进化方向还需在后续子代中进一步验证。

鲫鲤杂交鱼原始亲本RCC和CC的Mlh1基因CDS序列稳定差异在于CC较RCC在1076～1086 bp中段位置多出TAGTTCCTC碱基序列，且3'端结尾序列存在稳定差异及终止密码子不同，此序列位点翻译表达出的蛋白序列也存在稳定差异。这种双亲间存在一定差异，在杂交后代中独立表达且最终并未影响蛋白功能的内在表达调控机制尚有待进一步解析。在SPO11蛋白翻译水平上，RCC的精巢中同时表达出2种蛋白亚体，且相对分子量较大的SPO11-β亚体表达量高于相对分子量较小的SPO11-α亚体;CC和4nAT的精巢中仅表达相对分子量较大的SPO11-β亚体;F1的精巢中仅表达相对分子量较小的SPO11-α亚体。SPO11-β亚体通过与其他因子互作，参与常染色体DSB的产生;而SPO11-α亚体不能与其他相关因子互作，主要负责性染色体DSB的产生。此外，在DSB产生后的修复过程中，SPO11蛋白最终被移除（蒋涵玮等，2017）。综上所述，F1的精巢中仅高表达相对分子量较小的SPO11-α亚体，可能与其生殖细胞暂时被阻滞在DSB产生后的修复阶段，与SPO11-α亚体未被及时移除有关;而4nAT由于已完成减数分裂形成大量精子，导致SPO11-α亚体表达水平较低。该结论为探讨F1的生殖阻滞提供了重要参考依据。

4 结论

F1和4nAT能稳定杂合遗传原始亲本RCC的Spo11基因和Mlh1基因，虽然在CDS序列结构上存在少量差异，但最终都能独立表达相关蛋白，即杂交鱼形成过程中减数分裂关键基因的表达正常可为其跨越生殖障碍打下分子基础。

参考文献：

董然然，陈修云，王岗屹，吕昌乾. 2018. 贵州草海鲫鱼Spo11基因的克隆、生物信息学和表达分析[J]. 重庆师范大学学报（自然科学版），35（4）：25-30. [Dong R R，Chen X Y，Wang G Y，Lü C Q. 2018. Cloning，bioinformatic，and expression analysis of Spo11 gene of crucian carp in Caohai Lake of Guizhou Province[J]. Journal of Chongqing Normal University（Natural Science Edition），35（4）：25-30.] doi：10.11721/cqnuj20180405.

蒋涵玮，李涛，樊岁兴，江小华，史庆华. 2017. 减数分裂染色体的行为及其分子基础[J]. 中国科学：生命科学，47（1）：16-25. [Jiang H W，Li T，Fan S X，Jiang X H，Shi Q H. 2017. Chromosome behavior and the molecular basis of meiosis[J]. Scientia Sinica（Vitae），47（1）：16-25.] doi：10.1360/N052016-00336.

李建中，刘少军，张轩杰，鲁双庆，刘筠. 2005. 异源四倍体鲫鲤及其原始亲本遗传变异的微卫星标记分析[J]. 遗传学报，32（4）：378-383. [Li J Z，Liu S J，Zhang X J，Lu S Q，Liu Y. 2005. Microsatellite marker analysis of genetic variation between the allotetraploid crucian-carp and their original parents[J]. Acta Genetics Sinica，32（4）：378-383.]

李建中，鲁双庆，刘少军，刘正华，张轩杰，刘筠. 2003. 异源四倍体鲫鲤及其原始亲本遗传变异的RAPD分析[J]. 水产学报，27（5）：403-408. [Li J Z，Lu S Q，Liu S J，Liu Z H，Zhang X J，Liu Y. 2003. APD analysis of genetic variation between the allotetraploid hybrid of red crucian carp×common carp and their original parents[J]. Journal of Fisheries of China，27（5）：403-408.] doi：10.3321/j.issn：1000-0615.2003.05.003.

刘季芳，李伟，刘少军，陶敏，龙昱，刘筠. 2007a. 异源四倍体鲫鲤Sox4基因部分序列及其5'端调控区启动子片段的克隆与分析[J]. 自然科学进展，17（9）：1174-1180. [Liu J F，Li W，Liu S J，Tao M，Long Y，Liu Y. 2007a. Cloning and analysis of Sox4 gene sequence and promoter fragment of 5' terminal regulatory region of allotetraploid carp[J]. Progress in Natural Science，17（9）：1174-1180.] doi：10.3321/j.issn：1002-008x.2007.09.003.

刘季芳，刘少军，陶敏，李伟，刘筠. 2007b. 异源四倍体鲫鲤及其原始亲本Sox9基因HMG保守区内含子遗传变异性分析[J]. 自然科学进展，17（3）：313-319. [Liu J F，Liu S J，Tao M，Li W，Liu Y. 2007b. Analysis of genetic variability of introns in the HMG conserved region of allotetraploid carp（Carp carpio carpio） and its original parent Sox9 gene[J]. Progress in Natural Science，17（3）：313-319.] doi：10.3321/j.issn：1002-008X.2007.03.005.

劉少军，胡芳，周工建，张轩杰，何晓晓，冯浩，刘筠. 2000. 三倍体湘云鲫繁殖季节的性腺结构观察[J]. 水生生物学报，24（4）：301-306. [Liu S J，Hu F，Zhou G J，Zhang X J，He X X，Feng H，Liu Y. 2000. Gonadal structure of triploid crucian carp produced by crossing allotetraploid hybrids of Carassium auratus red var.（♀）×Cyprinus carpio（♂） with Japanese crucian carp（Carassius auratus Cavieri T. et S）[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，24（4）：301-306.] doi：10.3321/j.issn：1000-3207.2000.04.001.

尚婉婧，罗凤，罗廷文，穆利容，胡重江，王志坚，周林燕. 2016. 尼罗罗非鱼Spo11基因的克隆表达及RU486处理对其表达的影响[J]. 水生生物学报，40（2）：403-407. [Shang W J，Luo F，Luo T W，Mu L R，Hu C J，Wang Z J，Zhou L Y. 2016. Molecular cloning and expression analysis of Spo11 gene and expression change under RU486 treatment in nine tilapla[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，40（2）：403-407.] doi：10.7541/2016.53.

颜金鹏，刘少军，刘筠. 2007. 异源四倍体鲫鲤雌核发育后代及其亲本RAPD分析[J]. 水生生物学报，31（6）：905-908. [Yan J P，Liu S J，Liu Y. 2007. RAPD analysis of gynogens of allotetraploid hybrids and their parents[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，31（6）：905-908.] doi：10.3321/j.issn：1000-3207.2007.06.022.

颜金鹏，刘少军，孙远东，张纯，刘筠. 2005. 异源四倍体鲫鲤雌核发育后代的RAPD分析[J]. 水生生物学报，29（3）：259-265. [Yan J P，Liu S J，Sun Y D，Zhang C，Liu Y. 2005. RAPD analysis of diploid gynogen populations of allotetraploid hybrids of red crucian carp（♀）×common carp（♂）[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，29（3）：259-265.] doi：10.3321/j.issn：1000-3207.2005.03.005.

袁柳嬌，黄露，范思宇，李胜男，周天，赵如榕，陶敏，刘少军. 2020. 不同倍性鱼的gnih和gnihr3差异表达分析[J]. 水产学报，44（10）：1585-1598. [Yuan L J，Huang L，Fan S Y，Li S N，Zhou T，Zhao R R，Tao M，Liu S J. 2020. Comparative analysis of expression of gnih and gnihr3 genes in different ploidy fishes[J]. Journal of Fisheries of China，44（10）：1585-1598.] doi：10.11964/jfc.202007 12318.

Blokhina Y P，NguyenID A D，DraperID B W，Burgess S M. 2019. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks，synapsis，and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish，Danio rerio[J]. PLoS Genetics，15（1）：e1007730. doi：10.1371/journal pgen.100 7730.

Cannavo E，Sanchez A，Anand R，Ranjha L，Hugener J，Adam C，Acharya A，Weyland N，Aran-Guiu X，Charbonnier J B，Hoffmann E R，Borde V，Matos J，Cejka P. 2020. Re-gulation of the MLH1-MLH3 endonuclease in meiosis[J]. Nature，586（7830）：618-622. doi：10.1038/s41586-020- 2592-2.

Feitsma H，Leal M C，Moens P B，Cuppen E，Schulz R W. 2007. Mlh1 deficiency in zebrafish results in male sterility and aneuploid as well as triploid progeny in females[J]. Genetics，175（4）：1561-1569. doi：10.1534/genetics.106. 068171.

Hou H T，Kyriacou E，Thadani R，Klutstein M，Chapman J H，Cooper J P. 2021. Centromeres are dismantled by foundational meiotic proteins Spo11 and Rec8[J]. Nature，591（7851）：671-676. doi：10.1038/s41586-021-03279-8.

Johnson D，Crawford M，Cooper T，Bouuaert C C，Keeney S，Llorente B，Garcia V，Neale M J. 2021. Concerted cutting by Spo11 illuminates meiotic DNA break mechanics[J]. Nature，594（7864）：572-576. doi：10.1038/s41586-021-03389-3.

Lam I，Mohibullah N，Keeney S. 2017. Sequencing Spo11 oligonucleotides for mapping meiotic DNA double-strand breaks in yeast[J]. Methods in Molecular Biology，1471：51-98. doi：10.1007/978-1-4939-6340-9_3.

Liu S J，Liu Y，Zhou G J，Zhang X J，Luo C，Feng H，He X X，Zhu G H，Yang H. 2001. The formation of tetraploid stocks of red crucian carp×common carp hybrids as an effect of interspecific hybridization[J]. Aquaculture，192（2-4）：171-186. doi：10.1016/S0044-8486（00）00451-8.

Liu S J，Luo J，Chai J，Ren L，Zhou Y，Huang F，Liu X C，Chen Y B，Zhang C，Tao M，Lu B，Zhou W，Lin G L，Mai C，Yuan S，Wang J，Li T，Qin Q B，Feng H，Luo K K，Xiao J，Zhong H，Zhao R R，Duan W，Song Z Y，Wang Y Q，Wang J，Zhong L，Wang L，Ding Z L，Du Z L，Lu X M，Gao Y，Murphy R W，Liu Y，Meyer A，Zhang Y P. 2016. Genomic incompatibilities in the di-ploid and tetraploid offspring of the goldfish×common carp cross[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，113（5）：1327-1332. doi：10.1073/pnas.1512955113.

Ozakiy Y，Miura C，Miura T. 2006. Molecular cloning and gene expression of Spo11 during spermatogenesis in the Japanese eel，Anguilla japonica[J]. Comparative Bioche-mistry and Physiology. Part B：Biochemistry & Molecular Biology，143（3）：309-314. doi：10.1016/j.cbpb.2005.12.008.

Pasquier J，Cabau C，Nguyen T，Jouanno E，Severac D，Braasch I，Journot L，Pontarotti P，Klopp C，Postlethwait J H，Guiguen Y，Bobe J. 2016. Gene evolution and gene expression after whole genome duplication in fish：The PhyloFish database[J]. BMC Genomics，17：368. doi：10.1186/ s12864-016-2709-z.

Robert T，Vrielynck N，Mézard C，de Massy B，Grelon M. 2016. A new light on the meiotic DSB catalytic complex[J]. Seminars in Cell & Developmental Biology，54：165-76. doi：10.1016/j.semcdb.2016.02.025.

Tao M，Liu S J，Long Y，Zeng C，Liu J F，Liu L G，Zhang C，Duan W，Liu Y. 2008. The cloning of Dmc1 cDNAs and a comparative study of its expression in different ploidy cyprinid fishes[J]. Science in China. Series C：Life Science，51（1）：38-46. doi：10.1007/s11427-008-0004-1.

Wang J，Ye L H，Liu Q Z，Peng L Y，Liu W，Yi X G，Wang Y D，Xiao J，Xu K，Hu F Z，Ren L，Tao M，Zhang C，Liu Y，Hong Y H，Liu S J. 2015. Rapid genomic DNA changes in allotetraploid fish hybrids[J]. Heredity，114（6）：601-609. doi：10.1038/hdy.2015.3.

Ye L H，Jiao N，Tang X J，Chen Y Y，Ye X L，Ren L，Hu F Z，Wang S，Wen M，Zhang C，Tao M，Liu S J. 2017a. Chimeras linked to tandem repeats and transposable elements in tetraploid hybrid fish[J]. Marine Biotechnology，19（4）：401-409. doi：10.1007/s10126-017-9764-6.

Ye L H，Zhang C，Tang X J，Chen Y Y，Liu S J. 2017b. Variations in 5S rDNAs in diploid and tetraploid offspring of red crucian carp×common carp[J]. BMC Genetics，18（1）：75. doi：10.1186/s12863-017-0542-2.

Zhang C，Ye L H，Chen Y Y，Xiao J，Wu Y H，Min T，Xiao Y M，Liu S J. 2015. The chromosomal constitution of fish hybrid lineage revealed by 5S rDNA fish[J]. BMC Genetics，16：140. doi：10.1186/s12863-015-0295-8.

Zhang Y S，Li Z P，Nie Y，Ou G X，Chen C Z，Cai S Y，Liu L G，Yang P H. 2020. Sexually dimorphic reproductive defects in zebrafish with spo11 mutation[J]. Aquaculture Research，51（12）：4916-4924. doi：10.1111/are.14829.

（責任编辑 兰宗宝）

收稿日期：2021-06-28

基金项目：国家自然科学基金项目（31873038，31730098，U19A2040）;国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-45）

通讯作者：张纯（1980-），https：//orcid.org/0000-0002-9840-2205，博士，副教授，主要从事鱼类遗传育种研究工作，E-mail：zhang-chun421@163.com;刘少军（1962-），https：//orcid.org/0000-0001-5761-8571，博士，教授，中国工程院院士，主要从事鱼类繁殖与育种研究工作，E-mail：lsj@hunnu.edu.cn

第一作者：朱辣（1996-），https：//orcid.org/0000-0001-6072-5685，研究方向为鱼类遗传育种，E-mail：2966071937@qq.com