稳定期慢性阻塞性肺疾病患者微小RNA-181a表达水平及其与预后的关系▲

李翠娟 唐 颖 彭翠兰 慕丽娜 杨 雪 王春波 李 佳 王琳琳

(黑龙江省大庆龙南医院呼吸内科，大庆市 163453，电子邮箱：juanli085338@163.com)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)以不完全可逆的气流受限为特征，反复发作的急性加重会加剧气流受限，最终引起呼吸衰竭甚至死亡。目前，临床上主要通过药物、无创机械通气、有氧运动等方法治疗稳定期COPD，以预防急性加重的发作，减轻气流受限，进而提高患者的生活质量、延长生存时间。在治疗稳定期COPD患者过程中，准确评估病情、及时发现具有较高急性加重和死亡风险的患者，对更好地制定诊疗方案有重要意义。

气道炎症反应的持续存在在COPD发病中起重要作用，多项研究表明肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-18等促炎细胞因子的大量分泌与COPD的发病有关[1-3]。有学者发现，微小RNA(microRNA，miRNA)能够在转录后水平调节炎症基因的表达，其中miRNA-181a具有抑制炎症作用，可抑制香烟提取物诱导大鼠肺泡巨噬细胞释放TNF-α、IL-6、IL-8[4]。而临床研究显示稳定期COPD患者体内miRNA-181a的表达明显减少[5]。低表达的miRNA-181a是否与COPD的炎症激活、COPD的预后有关，目前尚未清楚。本研究探讨稳定期COPD患者外周血miRNA-181a表达情况，及其与预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年9月至2019年7月在我院就诊的300例稳定期COPD患者作为COPD组，纳入标准：(1)符合稳定期COPD的诊断标准[6]；(2)近8周临床症状稳定；(3)随访资料完整。排除标准：(1)合并呼吸道感染或正在使用抗生素治疗者；(2)合并肺癌、肺结核等其他呼吸系统疾病者；(3)合并自身免疫性疾病、恶性肿瘤等患者。另选取同期体检的150例健康志愿者作为对照组，两组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 两组一般资料的比较

1.2 研究方法

1.2.1 外周血miRNA-181a表达的检测：采集COPD组患者入院后次日及对照组志愿者体检当日的空腹静脉血3～5 mL，采用miRNA提取分离试剂盒(北京天根生化科技公司，批号：DP503)分离miRNA，然后采用miRNA cDNA第一链合成试剂盒(北京天根生化科技公司，批号：KR201)进行反转录得到miRNA对应的cDNA。采用荧光定量检测试剂盒(北京天根生化科技公司，批号：FP401)进行PCR实验，以U6为内参基因，按试剂盒说明书配置PCR的反应体系，包括cDNA 2 μL荧光定量检测试剂盒内的预混液10 μL、10 μmol/L的上下游引物各0.4 μL、去离子水补足至20.0 μL。于荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司)完成PCR，反应条件为95℃ 15 min后94℃ 20 s、60℃ 34 s(重复40个循环)。按照2-ΔΔCt计算miRNA-181a的表达量。

1.2.2 血清促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平的检测：采集COPD组患者入院后次日及对照组志愿者体检当日的空腹静脉血5～6 mL，采用酶联免疫吸附法试剂盒(上海西唐公司，批号：F00024、F00019、F00142、F00242、F00137)检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18的水平，均按照试剂盒说明书进行检测操作。

1.2.3 预后随访：随访时间为入组当天至2020年7月31日，共12～46个月，随访方式为每个月进行门诊复查或电话回访。随访的重点事件包括第一次发生急性加重、全因死亡。

1.3 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验；预后影响因素的分析采用Cox回归模型。采用GraphPad Prism 5.0软件进行Pearson检验、Kaplan-Meier曲线的绘制以及log-rank检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 COPD组与对照组miRNA-181a相对表达量和细胞因子水平的比较 与对照组比较，COPD组患者外周血miRNA-181a的相对表达量降低，血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平升高(均P<0.05)。见表2。

表2 两组miRNA-181a相对表达量和细胞因子水平的比较

2.2 COPD患者外周血miRNA-181a表达量与TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平的相关性 COPD患者外周血miRNA-181a的表达量与血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平呈负相关(均P<0.05)。见表3。

表3 COPD患者外周血miRNA-181a表达量与TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平的相关性

2.3 随访期间不同miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平的COPD患者首次急性加重的发生情况 根据COPD患者miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18的中位数将其分为miRNA-181a高表达组与低表达组、细胞因子高水平组与低水平组。绘制Kaplan-Meier曲线并行log-rank检验，结果显示，与miRNA-181a低表达患者比较，miRNA-181a高表达患者的急性加重累积发生率降低(P<0.05)；与TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18低水平患者比较，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18高水平患者的急性加重累积发生率相应增高(均P<0.05)。见图1。

图1 COPD组不同水平miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18患者急性加重情况的Kaplan-Meier曲线

2.4 随访期间不同miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平的COPD患者的死亡情况 绘制Kaplan-Meier曲线并行log-rank检验，结果显示，与miRNA-181a低水平患者比较，miRNA-181a高水平患者的累积病死率降低(P<0.05)；与TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18低水平患者比较，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18高水平患者的累积病死率相应增高(均P<0.05)。见图2。

图2 不同miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平COPD患者死亡情况的Kaplan-Meier曲线

2.5 COPD患者发生急性加重影响因素的Cox回归分析 以COPD患者发生急性加重情况为应变量(未发生急性加重=0，发生急性加重=1)，以miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18为自变量(以实际测得值进入模型)，进行Cox回归分析。结果显示miRNA-181a表达量、TNF-α和IL-6水平是COPD患者发生急性加重的影响因素(均P<0.05)，见表4。

表4 COPD患者发生急性加重影响因素的Cox回归分析

2.6 COPD患者死亡影响因素的Cox回归分析 以COPD组患者死亡情况为应变量(存活=0，死亡=1)，以miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18为自变量(以实际测得值进入模型)，进行Cox回归分析。结果显示miRNA-181a表达量、IL-6和IL-18水平是COPD患者死亡的影响因素(均P<0.05)，见表5。

表5 COPD患者死亡影响因素的Cox回归分析

3 讨 论

COPD具有反复发作的特点，可导致气道重塑及气流不可逆受限加重，最终发展为呼吸衰竭、肺源性心脏病及死亡。准确评估COPD病情、预测可能发生急性加重的高危患者，对制定诊疗方案具有积极意义，从而有助于改善COPD患者生活质量、延长生存时间、降低死亡率。肺功能测定、COPD评估测试评分是目前评价COPD病情的主要方法，但肺功能测定存在测定步骤复杂、需要重复多次检查、可操作性不强等缺点，COPD评估测试评分具有受主观判断影响较大的不足，用于评估远期预后的价值有限。

miRNA能够在转录后水平调节基因表达并具有广泛的生物学作用。多项研究显示，COPD患者外周血中存在多种miRNA的表达，且对病情及预后具有一定的评估价值[5,7-8]。气道慢性炎症反应是COPD的基本病理生理特征，而TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18等促炎细胞因子生成增多在COPD的气道炎症中起重要作用[1-3,9-11]。研究显示，miRNA-181a可以抑制炎症，miRNA-181a的低表达与COPD的发生有关[4-5]。本研究结果显示COPD患者血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平增加，外周血miRNA-181a表达量减少，且COPD患者外周血miRNA-181a的表达量与血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18的水平呈负相关(P<0.05)，提示在COPD的稳定期，miRNA-181a呈低表达，并可以负调控多种促炎因子，进而介导气道炎症、引起气流受限。

随着气流受限的加重，COPD患者出现病情急性加重甚至死亡[12]。多项研究显示，TNF-α、IL-1β、IL-18、细胞间黏附分子1等炎症指标对COPD患者的预后具有评估价值[13-15]。但COPD气道炎症的激活涉及复杂的细胞因子网络，COPD患者体内起促炎作用的细胞因子可能存在个体差异，单纯根据一种或几种促炎细胞因子对患者的病情进行预后评估具有一定的局限性。miRNA-181a作为炎症反应的上游调控分子，同时参与多种促炎因子的调控，其在病情及预后的评估中可能有一定的价值。本研究结果显示miRNA-181a低表达与稳定期COPD患者急性加重累积发生率、累积病死率更高；进一步的Cox回归分析结果显示，miRNA-181a、TNF-α、IL-6是稳定期COPD患者发生急性加重的影响因素，而miRNA-181a、IL-6、IL-18是稳定期COPD患者死亡的影响因素。提示miRNA-181a低表达是稳定期COPD患者不佳的危险因素，miRNA-181a或有助于评估稳定期COPD患者的预后。

综上所述，稳定期COPD患者miRNA-181a表达降低，且与促炎细胞水平TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平呈负相关。miRNA-181a表达降低是稳定期COPD患者发生急性加重或死亡的危险因素。但本研究为单中心研究且随访时间较短，今后将延长随访时间、进行多中心研究验证结果。