越南紫薯胚性愈伤组织诱导及体细胞胚胎形成

胡根海，张晓红，赵元增

（河南科技学院生命科技学院/现代生物育种河南省协同创新中心，河南 新乡 453003）

【研究意义】紫薯〔Ipomoea batatas（L.）Lam〕又称紫心甘薯、黑薯，为1 年生旋花科类草本植物，因薯肉常呈紫色或紫黑色而得名。紫薯不仅可以直接食用，而且还可以用于色素提取、饮品开发，具有更广应用价值［1］。越南紫薯与一般的紫薯相比，淀粉和维生素含量更高，口感特别粉糯。和普通国产紫薯相比，越南紫薯果肉皮薄细嫩，薯香浓郁，肉质细腻，但薯块较小。目前紫薯的薯块均较小，平均每667 m2产量在2 000 kg 左右［2］，如审定品种宁紫薯1 号2 年平均为1 805.6 kg，远低于普通甘薯3 000 kg 以上的产量。因此改良越南紫薯提高产量稳定品质成为当前研究热点。【前人研究进展】生产上常用茎尖培养生产脱毒苗［3］。在薯苗培育过程中要消耗大量的薯块，这直接导致栽培种苗无法满足人们的需求［4-5］。组织培养可以诱导形成胚性愈伤，胚性愈伤进一步发育形成体细胞胚胎，体细胞胚胎发育为植株，在体细胞胚胎分化扩繁过程中可以显著提高繁殖系数。甘薯是种性退化速率较高的作物，无性繁殖几代后薯块品质即下降，体细胞胚是相对稳定的繁殖方式，有利于种苗繁育的遗传稳定。有研究报道甘薯的块根组织培养已获得愈伤组织，但未获得胚性愈伤［6］，通过茎尖、叶片培养易获得愈伤组织，同时可获得少量胚性愈伤［7-8］。已有研究认为胚性愈伤组织的诱导率可能与甘薯基因型有关，不同基因型的甘薯诱导率差异极大［9］。目前紫薯多见诱导愈伤的报道［10-11］和茎尖培养直接成苗技术［12-14］，而且这些材料是20 世纪90 年代最初引进的紫肉甘薯品种日本农家种山川紫的后代。【本研究切入点】越南紫薯是紫薯一个新引进种，其组织培养还未见报道，试验拟以越南紫薯为材料，以叶片和茎段作外植体，分析6-BA 和NAA 在愈伤组织诱导中的作用，2,4-D 和6-BA 在愈伤组织转变为胚性愈伤组织、ABA 在胚性愈伤形成体细胞胚胎中的作用，探讨在MS 培养基中附加植物生长调节物诱导胚性愈伤并分化为体细胞胚的有效方案。【拟解决的关键问题】筛选适合越南小紫薯基因型的外植体诱导愈伤组织、胚性愈伤和体细胞胚的适宜培养基，为越南紫薯的工厂化育苗和遗传改良提供途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试越南紫薯于2020 年3 月6 日购自超市蔬菜区。

1.2 试验方法

1.2.1 紫薯催芽育苗 2020 年3 月8 日培养盒中排列紫薯，用细沙覆盖，浇水保持湿润，置于25～30 ℃培养箱中暗培养，约10 d 左右出芽，待芽长到20 cm 时备用。

1.2.2 外植体获得 挑选幼嫩正在生长的叶片和茎段，流水冲洗后，在超净工作台上，先用体积分数70%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗1～2 次，再用质量分数0.1% HgCl2消毒2～3 min，无菌水冲洗4～6 次，无菌滤纸吸干表面水分，无菌剪刀将叶片剪成0.5 cm×0.5 cm 的小方块，茎段剪成1 cm，接种到30 mL 固体MS 培养基上，25（±0.5）℃黑暗培养3 周后，转至培养室25（±0.5）℃光照培养，光照条件2 000～3 000 μmol/（m2·s），光照时间16 h/d，诱导获得的愈伤组织。

1.2.3 激素组合 激素组合见表1，其中A、B、C、D 分别代表6-苄氨基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）、萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D）和脱落酸（abscisic acid,ABA）的浓度，与编号对应的为浓度，如A1 表示6-BA 的浓度为0.1 mg/L，B2 表示NAA 浓度为0.6 mg/L，A1B2 表示在培养基中添加的6-BA 浓度为0.1 mg/L，NAA 浓度为0.6 mg/L。对紫薯叶片、茎段进行愈伤组织诱导时仅使用A、B 激素组合，胚性愈伤组织诱导使用A、C 激素组合，体细胞胚胎诱导使用A、B、D 激素组合。

表1 培养基不同激素处理Table 1 Different hormone treatments in medium（mg/L）

1.2.4 愈伤组织诱导 愈伤组织诱导的基础培养基为MS 培养基，添加蔗糖30 g/L、植物凝胶2.6 g/L 及不同浓度的6-BA 和 NAA，调节pH 至5.8，高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌15～20 min。将紫薯茎段和叶片外植体，分别接种至诱导培养基，每瓶5 个外植体，3 次重复。在诱导起始阶段进行7 d 的黑暗处理，接着转至光照下培养，培养温度25（±0.5）℃，光照强度为1 200 μmol/（m2·s），光照时间16 h/d，培养30 d 后统计并记录愈伤组织产生情况。

1.2.5 胚性愈伤组织诱导 分化培养基为MS 基础培养基，添加蔗糖40 g/L、植物凝胶2.6 g/L 及不同浓度的6-BA 和2,4-D，调节pH 至5.8，高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌15～20 min。将1.2.4诱导的愈伤组织接种至分化培养基中，每瓶3 块，培养温度25（±0.5）℃，光照强度1 200 μmol/（m2·s），光照时间16 h/d，培养60～80 d 后统计并记录胚性愈伤组织诱导率、出胚率。

1.2.6 体细胞胚胎诱导 体胚诱导培养基为MS基础培养基，添加蔗糖30 g/L、植物凝胶2.6 g/L及不同浓度的6-BA、NAA 和ABA，调节pH 至5.8，高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌15～20 min。将1.2.5 诱导获得的胚性愈伤放置于体胚诱导培养基上进行出胚诱导，继代2 周后可见产生体胚，每个培养基10 瓶，每瓶3 个愈伤块，培养温度28（±0.5）℃，光照强度1 200 μmol/（m2·s），光照时间16 h/d，出胚后统计并记录出胚率。

1.2.7 体细胞胚植株再生及炼苗移栽 将成熟的体胚转移至MS 培养基上，培养发育成正常小植株时，逐渐打开瓶口，7 d 后移栽至基质中。

愈伤组织诱导率（%）=长出愈伤的外植体数/总外植体数×100

愈伤组织初始接种质量=接种后培养基质量－原培养基质量

愈伤组织生长量=培养30 d 后愈伤组织质量－愈伤组织初始接种质量

出胚率（%）=出胚愈伤块数/总愈伤块数×100

试验数据采用SPSS17.0 统计分析软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 激素对越南紫薯不同外植体愈伤组织诱导的影响

试验对越南紫薯嫩叶和茎段同时进行愈伤组织诱导，结果显示暗培养7 d 后，外植体的切口处均出现愈伤组织，茎段更为明显，切口处可见黄白色愈伤组织。随后，愈伤组织继续生长，在叶片的四周切口处均出现愈伤组织，茎段外植体两端形成愈伤组织块，逐渐呈哑铃状（图1A）。A、B 两种激素不同浓度组合对叶片和茎段愈伤组织诱导率的影响无显著差异（表2），两种外植体愈伤诱导率在所有激素浓度组合均达到100%，且愈伤组织颜色、质地和生长状况均良好，说明6-BA 和NAA 组合有利于紫薯愈伤组织的诱导；但不同浓度和组合愈伤组织生长量存在差异，愈伤组织状态也不同，当NAA 浓度相同时，随着6-BA 浓度的升高，愈伤组织生长量逐渐增高，最佳6-BA 浓度为1.0 mg/L，过高的6-BA 浓度也会抑制愈伤组织生长量；NAA 浓度较低时诱导的愈伤组织呈黄绿色疏松，高浓度诱导的愈伤组织较致密，NAA 浓度为0.2 mg/L、6-BA 浓度为1.0 mg/L 时，诱导效果优于较高激素浓度。

表2 不同激素组合对愈伤组织诱导的影响Table 2 Effects of different hormone combinations on callus induction

2.2 激素对越南紫薯胚性愈伤组织诱导的影响

将叶片或茎段诱导的愈伤组织，转接至胚性愈伤组织诱导培养基中，进行胚性愈伤组织诱导。诱导8 周左右，结果显示胚性愈伤组织与普通愈伤组织有明显形态差异（图1B）。不同激素配比胚性愈伤组织形成效果差异明显，由表3 可知，在愈伤组织向胚性愈伤组织转化过程中，2,4-D起着重要作用，2,4-D 浓度过低过高均不利于胚性愈伤组织的形成，2.0 mg/L 为最佳胚性愈伤组织诱导浓度；不同6-BA 浓度对胚性愈伤出愈率影响不同，其中0.1 mg/L 有利于增加胚性愈伤组织出愈率，较高6-BA 浓度不利于胚性愈伤组织的形成，且浓度越高出愈率降低。

表3 不同激素组合对胚性愈伤组织诱导的影响Table 3 Effects of different hormone combinations on embryogenic callus induction

2.3 激素对越南紫薯体细胞胚诱导的影响

胚性愈伤组织转移至体细胞胚诱导培养基上培养2周后，开始体胚分化，逐渐出现绿色的胚（图1C），随着时间延长，体细胞胚越来越大，直至发育成成熟胚（图1D）。培养30 d 后统计体细胞胚胎个数，由表4 可知，不同激素组合诱导所得体细胞胚胎有较大的差异，最高为A1B1D3 组合（MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ABA 0.5 mg/L），综合分析3 种激素水平体细胞胚胎的获得及其后续进一步成长情况可知，当NAA 处于较高水平时，出胚率较低，且随6-BA 浓度水平提高也呈现出胚率降低的趋势。

表4 不同激素组合对胚性愈伤体胚化诱导的影响Table 4 Effects of different hormone combinations on embryogenesis of embryogenic callus

2.4 体细胞胚胎诱导成苗及移栽驯化

将不同激素组合培养基诱导获得的体细胞胚转入MS ＋蔗糖3%的培养基上，使其进一步发育生长成苗（图1E、F）。由表4 可知，不同来源体细胞胚胎后续生长表现有差异，由A1B1D3培养基诱导的体细胞胚的成苗率最高为77.8%，其次为A2B4D2、成苗率61.1%，其余培养基诱导的体细胞胚成苗率均较低，部分未能发育成植株，且其体细胞胚发育过程中有白化干枯死亡现象。

3 讨论

3.1 不同外植体对愈伤组织形成的影响

不同甘薯品种其愈伤组织形成能力也不同［14-15］，而且外植体不同其形成愈伤组织的难易程度也不同［16-18］。本试验发现越南紫薯叶片和茎段在相同激素组合处理下，形成愈伤的能力基本一致，但愈伤生长量略有差异，叶片形成的愈伤量略高，这与周丽艳等［19］的研究结果一致，而且由于叶片易采集数量多，形成愈伤组织量较高，因此适宜作细胞工程初始培养的外植体。紫薯外植体愈伤组织形成的决定因素是激素组合，如6-BA 的使用量直接影响愈伤生长量，较低和过高的6-BA 浓度均导致愈伤生长量偏低，较低的NAA 浓度有利于增加愈伤组织生长量。越南紫薯诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

3.2 愈伤组织诱导产生胚性愈伤组织

甘薯诱导愈伤组织可以分为非胚性愈伤组织和胚性愈伤组织2 类，一般直接由外植体诱导产生的愈伤组织为非胚性愈伤组织，这种愈伤呈水乳状，乳白色，结构疏松，且生长旺盛，但不能直接产生体细胞胚胎，从而再生成植株［19-20］。紫薯工厂化种苗生产需要大量体细胞胚胎，这需要通过改变培养条件将非胚性愈伤组织转变为胚性愈伤组织，从而形成大量体细胞胚胎，培育所需的再生苗。已有研究认为胚性愈伤组织的形成与激素和品种有关［10］，对单一品种而言，主要是激素影响胚性愈伤组织的形成。本试验发现越南紫薯胚性愈伤组织的形成起主要作用的是2,4-D，较低或过高的2,4-D 直接影响胚性愈伤组织的形成和数量，这与杨强强等［21］、崔红等［22］的结论一致，6-BA 对胚性愈伤组形成有辅助作用，适宜的6-BA 浓度可以使胚性愈伤组织量达到最大。

3.3 胚性愈伤组织诱导产生体细胞胚胎

胚性愈伤组织进一步发展的方向与培养基的成分和激素有关，只有适宜的培养基和激素浓度才能获得较多的体细胞胚胎。ABA 对胚性愈伤组织诱导发育为体细胞胚胎起着重要的作用［23-24］，对刺槐的研究发现诱导产生胚性愈伤组织后继续在高浓度激素下继代，胚性愈伤组织会持续脱分化，不能产生体细胞胚胎［25］。本试验将胚性愈伤组织转移至体细胞胚诱导培养基上，不同继代培养基表现出不同诱导效果，在低6-BA 和NAA 浓度下，胚胎率诱导与ABA 有关，在0.5 mg/L 浓度体细胞胚胎有较高发生率；较高的6-BA 和NAA浓度都会导致体细胞胚胎发生率降低，而高NAA浓度体细胞胚胎发生率为零。说明在较低浓度6-BA 和NAA 下，培养基再附加一定浓度的ABA有利于紫薯体细胞胚胎发生，本试验的最佳组合为MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ABA 0.5 mg/L。

4 结论

本研究结果表明，越南紫薯叶片和茎两种外植体接种在普通愈伤组织诱导培养基上，黑暗处理1 周后转至光照下继续培养，叶片具有略高的愈伤组织形成能力，其诱导培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；愈伤组织必须转化为胚性愈伤组织才能进一步发育形成体细胞胚胎，由愈伤组织到胚性愈伤组织转化需要高浓度的2,4-D 诱导和低浓度6-BA 辅助，其最佳培养基为MS+6-BA 0.1 mg/L +2,4-D 2.0 mg/L。胚性愈伤出现后，需要撤掉2,4-D，改用MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ABA 0.5 mg/L 才能诱导形成体细胞胚胎。在胚性愈伤进一步发育为体细胞胚胎过程中，低6-BA 和NAA 浓度下诱导胚胎率与ABA有关，体细胞胚胎可在MS ＋蔗糖3%培养基上生长成苗。