甘露醇注射液一致性评价有关物质研究

李家和，许龙，曹阳，黄顺旺

甘露醇注射液国内有多家药企生产，甘露醇静脉作用快，很少发生反跳现象，为临床上广泛使用的脱超纯水利尿药，其在急性肾功能衰竭的预防、颅内压降低与脑水肿治疗方面，属于常用和首选的药物。药物中杂质会影响稳定性、降低疗效，甚至对人体健康有害或产生副作用，有关物质研究在一致性评价中尤为重要。根据CDE 已上市化学仿制药（注射剂）一致性评价技术要求，参比制剂首选国内上市的原研药品（上海百特医疗用品有限公司），有关物质研究重点对制剂及原料药的降解产物进行研究。欧洲药典EP9.0、美国药典USP40及日本药典JP17甘露醇原料标准均收载3个已知杂质，即杂质A（山梨醇）、杂质B（麦芽糖醇）和杂质C（异麦芽酮糖醇）。上述药典与中国药典甘露醇注射液标准中均未收载有关物质检查项。本研究于2018年1月至2019年6月建立并经验证的方法，可有效检出甘露醇注射液中各已知杂质，主峰与相邻杂质峰得到良好分离。其中，杂质A（山梨醇）为甘露醇的异构体，杂质B（麦芽糖醇）为山梨醇与葡萄糖结合生成的杂质，杂质C（异麦芽酮糖醇）为甘露醇与山梨醇分别与葡萄糖从侧端结合生成的杂质。其结构式如下所示。

1 仪器与试药

高效液相色谱系统（岛津LC-20A）：泵单元（LC-20AT），示差检测器（RID-10A），色谱数据工作站（Labsolutions DB版）。

甘露醇对照品（批号100533-201304，99.0%）购自中国食品药品检定研究院；杂质A（批号170810，98.03%）购自上海展云化工有限公司；杂质B（批号R022L0，99.8%）、杂质C（批号R05510，96.6%）购自美国药典会；供试用制剂（ 批号20181103、20181104、20181105）为安徽双鹤药业有限责任公司生产；参比制剂（批号S1711090，规格250 mL∶50 g）购自上海百特医疗用品有限公司；市售制剂（批号17031312，规格100 mL∶20 g）购自四川科伦药业股份有限公司；水为超纯水。

图1 甘露醇注射液中各已知杂质结构式：A为杂质A（山梨醇）；B为杂质B（麦芽糖醇）；C为杂质C（异麦芽酮糖醇）

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

取本品，加超纯水稀释制成每毫升含50 mg 的溶液，滤过，取续滤液作为各供试品溶液；精密量取2 mL，置100 mL量瓶，用超纯水稀释定容，摇匀，即自身对照溶液；取甘露醇对照品2.5 mg，置100 mL 量瓶中，加超纯水溶解制成每毫升中含25 μg的溶液，作为0.05%对照溶液，即灵敏度溶液。

2.2 色谱条件和系统适用性

通过考察杂质A、B、C 及主成分峰保留时间、主峰与相邻杂质峰的分离度，进行了色谱条件的筛选，试验方法和结果如下：按照高效液相色谱法（中国药典2015 版四部通则0512）试验：以填充剂为磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物的强阳离子钙型交换柱（300 mm×7.8 mm），以超纯水为流动相，流速为0.5 mL/min，柱温为80 ℃，示差折光检测器，检测温度为40 ℃。取甘露醇对照品、杂质A、杂质B、杂质C 各适量，加超纯水配制成每毫升约含甘露醇50 mg、杂质A 1.0 mg、杂质B 1.0 mg、杂质C 1.0 mg，取20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，见图2所示。各组分出峰顺序依次为杂质C（峰Ⅰ）、杂质B和杂质C（峰Ⅱ）、甘露醇、杂质A，甘露醇峰与杂质A 峰之间的分离度大于2.0，分离度符合要求，专属性较高且各杂质峰的理论板数均大于2000，系统适用性符合要求。

图2 甘露醇注射液一致性评价系统适用性试验色谱图

2.3 专属性

进行破坏性试验以考察甘露醇降解产物在本方法条件下的分离情况。分别移取甘露醇注射液（批号20181103）2.5 mL 三份，置10 mL 量瓶中。第1份加1 mol/L盐酸溶液2 mL，在40 ℃稳定性试验箱中反应8 d，加超纯水稀释至刻度，摇匀，即得酸破坏样品；第2 份加1 mol/L 氢氧化钠溶液2 mL，在25 ℃稳定性试验箱中反应16 d，加1 mol/L 盐酸溶液2 mL中和，加超纯水稀释至刻度，摇匀，即得碱破坏样品；第3 份加30% 双氧超纯水2 mL，在40 ℃稳定性试验箱中8 d，加超纯水稀释至刻度，摇匀，即得氧化破坏样品。将甘露醇注射液（批号20181103）一瓶放置在80 ℃干燥箱中21 d，取2.5 mL，置10 mL 量瓶，用超纯水稀释定容，摇匀，即高温破坏样品。将甘露醇注射液（批号20181103）一瓶放置在5000 Lx 照度的稳定性试验箱中27 d，取2.5 mL，置10 mL 量瓶，用超纯水稀释定容，摇匀，即光照破坏样品。精密量取上述各溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱图见图3。结果可见：本品在酸、高温、光照破坏条件下，未产生降解杂质，在碱、氧化破坏后，主峰及杂质A 与其相邻杂质峰分离度良好，破坏前后的物料基本守恒。

图3 甘露醇注射液一致性评价专属性试验HPLC色谱图

2.4 定量限、检测限、线性范围

分别称取甘露醇对照品、杂质A、B、C 对照品适量，配制成含甘露醇对照品、杂质A、B、C 对照品约为50、250、500、1000、2000 mg/L 的混合溶液。其中检测限信噪比约为3；定量限信噪比约为10。精密量取定量限溶液与上述各对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。对照品浓度作为横坐标（

X

），峰面积作为纵坐标（

Y

），采用线性回归分析，结果见表1。

表1 甘露醇与各已知杂质定量限、检测限与线性

结果表明：甘露醇浓度在4.32～2003.83 mg/L 范围内，杂质A 浓度在5.12～1981.77 mg/L 范围内，杂质B 浓度在4.11～1982.61 mg/L 范围内，杂质C 浓度在6.92～1947.46 mg/L 范围内，其浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度与准确度

精密度：按“2.1”项下方法制备供试品6 份，在“2.2”色谱条件下，以高效液相色谱仪进行测定，计算各杂质含量相对标准差（RSD）。6 份供试品溶液中，超过报告限度（0.05%）杂质（杂质A）含量的RSD 为0.85%，小于5.0%，总杂RSD不大于5.0%，本方法精密度良好。

准确度：精密量取混合对照品贮备液，加入供试品中，制成加入各已知杂质为限度的80%、100%、120% 的回收率样品，进样分析，记录色谱图，计算各已知杂质回收率。杂质A、B、C 的平均回收率依次为102.62%、101.36%、103.11%，RSD 依次为1.14%、1.01%、0.82%，本方法准确度良好。

2.6 溶液稳定性

按“2.1”“2.2”项下制备供试品溶液与系统适用性溶液，25 ℃放置，并于0、2、4、6、8、12、24 h分别取样进样分析，记录色谱图。系统适用性溶液24 h 内甘露醇的峰面积RSD 为0.13%，杂质A 的峰面积RSD 为0.18%，杂质B 的峰面积RSD 为0.17%；供试品溶液24 h 内甘露醇主成分峰面积RSD 为0.14%，杂质A 的峰面积RSD 为0.75%，RSD均小于2%，因此，系统适用性溶液及供试品溶液在室温条件下放置24 h稳定。

2.7 耐用性

通过分别调整色谱条件中的流速（±0.05 mL/min）、柱温（±5℃）、检测器温度（±5℃）及更换不同色谱柱等，来考察杂质与主成分之间分离度的影响及大于0.05% 杂质含量变化。与正常条件比较，各条件下杂质检出个数一致，大于0.05% 单杂、总杂含量RSD符合要求，表明本方法耐用性良好。

2.8 样品测定

按上述已确定的色谱条件及方法，检查本品中试3批及参比制剂1批、市售制剂1批样品的有关物质。已知杂质按加校正因子的自身对照法计算，未知杂质按不加校正因子的自身对照法计算。结果见图4。

图4 甘露醇注射液有关物质检测色谱图

由检测结果可知，5 批样品（20181103、20181104、20181105、市售制剂17031312、参比制剂S1711090）均能检出已知杂质A，依次为0.19%、0.20%、0.34%、0.50%、0.52%。未检出已知杂质B 和已知杂质C，未知杂质均小于报告限（0.05%），且3批自制样品有关物质总体不高于参比制剂与市售制剂。

3 讨论

有关文献仅研究了杂质A 或完全参照中国药典2015 版原料药“甘露醇”有关物质项下方法。本研究基于EP9.0 原料药“Mannitol”有关物质项下方法，同时结合各国药典质量标准，进行了色谱条件筛选、优化。选用填充剂为磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物的强阳离子钙型交换柱，色谱柱型号为BIO RADAminex HPX-87C（300 mm×7.8 mm），流速为0.5 mL/min，柱温为80 ℃，示差折光检测器温度为40 ℃，主峰与各杂质峰峰型良好，保留时间适宜。以超纯水为流动相，可有效改善溶剂的负吸收峰，故选用上述条件确定了最终色谱条件。

参照中国药典《药品质量标准分析方法验证指导原则》，对已知杂质A、B、C 进行了方法验证研究，杂质A、B、C 的校正因子均值依次为1.00、1.02、0.98，均在0.9～1.1 之间。参照《化学药物杂质研究技术指导原则》，各已知杂质含量均可采用主成分自身对照法计算。本研究建立的甘露醇注射液有关物质检测方法操作简便、结果准确、重现性好，为该注射液质量一致性评价提供试验依据。