铁皮石斛锈病病原鉴定及药剂筛选

罗 凯，李泽生，姜 艳，贾 敏，高 燕，耿秀英，李桂琳

(云南省德宏热带农业科学研究所，云南 瑞丽 678600)

铁皮石斛(Dendrobium officinale)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生草本植物，是我国特有的药用植物，独特的生长环境造就其非凡的品质，具有“养阴生津、润喉护嗓、温胃明目、补肾益力、延年益寿”等功效[1]，药材应用历史悠久，是《中国药典》(2015版)收载的4种石斛之一[2]。铁皮石斛其有性繁殖结实率低，蒴果虽然具有很多粒微小种子，但是它的种子缺乏胚乳，需要特殊的共生菌提供营养才能萌发[3—5]。由于人类过度采挖和毁林开荒导致铁皮石斛原生境丧失，其野生种群数量急剧减少，已被纳入中国物种红色名录，属于濒危物种[6]。随着组培技术的快速发展[7]，栽培水平不断提高，人工大棚种植的铁皮石斛种植面积不断增加，单一大面积种植、高温高湿的大棚环境导致了铁皮石斛病害的发生，铁皮石斛轮纹病、根腐病、黑斑病、软腐病、锈病相继报道[8—12]。近年来，铁皮石斛锈病在云南省德宏州大面积发生，严重影响铁皮石斛的正常生长。为更好掌握铁皮石斛锈病的发生情况，开展病害防治工作，笔者对该种植区发生的锈病及其发病规律进行调查，对病原菌种类进行鉴定，筛选防治药剂，为生产中防治该病提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点及材料

试验地点位于云南省德宏州瑞丽市勐秀乡铁皮石斛种植基地，选择叶面干净，锈菌孢子堆明显，病斑单一的锈病样品进行采集。选择生产上常用的防治药剂(表1)。

表1 供试杀菌剂Table 1 Fungicides for test

1.2 病原菌鉴定

选择铁皮石斛叶锈病症状明显的病组织，将其孢子堆做成玻片，观察孢子形态和颜色，测量孢子大小，对病原菌进行鉴定[13—14]。将锈病病菌样品送昆明硕擎生物有限公司进行分子测序，在NCBI网站进行序列比对分析。

1.3 发病规律

2018年3月至2020年3月对铁皮石斛锈病进行定点观察，记录发病时间，危害症状、危害程度，观察铁皮石斛叶锈病孢子及孢子堆。

1.4 药效试验

选择4种药剂设5个处理，即430 g·L-1戊唑醇悬浮剂 375 mL·hm-2、 42.8% 氟菌·肟菌酯悬浮剂450 mL·hm-2、10%苯甲·丙环唑悬浮剂 450 mL·hm-2、75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂 300 g·hm-2、清水空白对照(CK)。每处理3次重复，共设15个小区，小区面积18 m2、采用完全随机区组设计，各试验小区四周设保护行隔离，每处理喷雾等量药液或清水。每7 d施药一次，正常药量，共施药3次，于2018年8月5日、12日、19日各施药1次，正常药量。施药后 7 d调查各小区病害发生情况，采取对角线5点取样，每点调查20丛，每丛调查5个叶片，计算各处理病情指数及防治效果。病情分级标准为：0级，无病斑；1级，病斑面积≤1/10叶面积；2级，病斑面积≤1/5叶面积；3级，病斑面积≤1/2叶面积；4级，病斑面积≤3/4叶面积；5级，病斑面积＞3/4叶面积。计算病情指数和相对防效，公式如下：

病情指数=∑(病级数值×该病级叶数)/(病级最高值×调查叶数)×100；

相对防效(%)=1-(药后对照区病情指数×药后防治区病情指数)/(药前对照区病情指数×药前防治区病情指数)×100%

1.5 数据分析

采用SPSS V19.0.0软件作单因素分析及Duncan氏新复极差法检验差异显著性。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛锈病病原菌形态与分子鉴定

采集的铁皮石斛锈病夏孢子呈黄色，近圆形或不规则椭圆形，直径 20～30 μm，后期颜色逐渐变深(图1)；冬孢子呈红褐色，短棒形或不规则形状，孢子长50～140 μm。铁皮石斛锈病病原菌形态鉴定为担子菌亚门(Basidiomycota)冬孢菌纲(Teliomycetes)锈菌目(Uredinales)鞘锈菌科(Coleosporaceae) 鞘锈菌属真菌(Coleosporiumsp.)。通过NCBI网站对所获得的石斛锈菌的ITS序列进行同源性比较，发现铁皮石斛锈病病原菌种类与形态鉴定种类结果一致，同为真菌鞘锈菌(Coleosporiumsp.)。

图1 铁皮石斛锈病病原菌夏孢子形态Fig. 1 Urediospores of Dendrobium officinale rust disease

2.2 铁皮石斛锈菌发病规律

铁皮石斛锈病的发生期为2～11月，主要危害铁皮石斛叶片。2月随着气温升高，铁皮石斛锈病病菌从叶片背面侵染，发病初期叶片出现浅黄色、水渍状小斑，叶片被侵染部位逐渐退绿，周围有浅绿色晕染，此时在体式显微镜下可观察到浅黄色的粉状孢子堆(图2: A)，在初期病斑周围形成一圈深红色病斑，不久即发展成为块状孢子堆，一片叶上可形成一个或多个病斑，为黄色或暗红色。继而叶面的黄色斑点逐渐扩大呈深黄色和深褐色，叶背黄斑扩大呈环状(图2: B)，在体式显微镜下可观察到大量附着的深黄色的孢子(图2: C)，危害严重时所有叶片干枯脱落，茎尖停止生长，铁皮石斛假鳞茎缩水变干，降低产量和品质。10月中旬冬孢子开始形成，病斑呈红褐色，环状(图2: D)，铁皮石斛锈病以冬孢子越冬，翌年春季侵染叶片。7～9月是铁皮石斛叶锈病发病高峰期，雨季的高温高湿环境有利于孢子囊形成和孢子萌发，孢子可借风、雨、昆虫传播，侵染健康叶片及邻近植株叶片，并迅速繁殖和扩散传播，造成多次侵染，导致病害蔓延。无降雨季节，病害发展较慢，但人工喷灌浇水也会促进病害发展。

图2 铁皮石斛锈病症状Fig. 2 Symptoms of Dendrobium officinale rust disease

2.3 供试药剂对铁皮石斛锈病的田间防效

施药后均未发生药害，表明4种药剂处理对锈病均有一定的防效(表2)。4个药剂处理在施药3次后，铁皮石斛锈病的病情指数逐渐降低、防效逐渐增加，第3次药后7 d病情指数最低、防效最好。430 g·L-1戊唑醇悬浮剂 375 mL·hm-2和 42.8%氟菌·肟菌酯悬浮剂450 mL·hm-2处理的平均防效分别在45.91%～70.61%、44.72%～66.10%之间，病害程度中等偏轻；10%苯甲·丙环唑悬浮剂 450 mL·hm-2和75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂300 g·hm-2处理的平均防效分别在55.59%～82.16%、47.53%～82.88%之间，病害程度偏轻；而空白对照的平均病指在24.56～32.46之间，病害程度偏重，且略有加重趋势。第1次施药后7 d，4个药剂处理的防效差异均不显著；第2次施药后7 d，42.8%氟菌·肟菌酯悬浮剂与 75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂处理的防效差异显著，75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂、10%苯甲·丙环唑悬浮剂与的防效差异不显著；第3次施药后7 d，430 g·L-1戊唑醇悬浮剂与42.8%氟菌·肟菌酯悬浮剂的防效差异显著，42.8%氟菌·肟菌酯悬浮剂与 10%苯甲·丙环唑悬浮剂、75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂处理的防效差异显著；3次防效试验调查中，10%苯甲·丙环唑悬浮剂处理与 75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂处理的防效均没有显著差异。由此可知，10%苯甲·丙环唑悬浮剂与 75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂防效一样，在第3次施药后7 d时防效达最高，分别为82.16%和82.88%，防效较好。

表2 不同药剂处理对铁皮石斛锈病的防治效果Table 2 Disease index and control effect of different treatments on Dendrobium officinale rust disease

3 结论与讨论

病原菌的形态学鉴定与分子生物学鉴定结果表明，铁皮石斛锈病病原菌为鞘锈菌属真菌(Coleosporiumsp.)，鞘锈菌属真菌通常引起松针锈病，其冬孢子对寄主植物的选择并不十分严格，寄主范围广泛，一种植物上通常有多种鞘锈菌，而同一种鞘锈菌也可以寄生不同的植物[13]，使得鞘锈菌属真菌鉴定较为困难，本研究与席刚俊等[12]研究结果一致，铁皮石斛锈病的病原菌同为鞘锈菌属真菌，是否由花椒鞘锈菌(Coleosporium zanthoxyli)引起，需进一步研究确定。胡永亮等[15]鉴定了齿瓣石斛(Dendrobium devonianum)锈病的病原为柄锈菌属真菌(Puccinia sp.)，赵桂华等[16]报道齿瓣石斛锈病的病原为鸡矢藤鞘锈菌(Coleosporium paederiae)。

铁皮石斛锈病防治药剂筛选试验表明，75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂与 10%苯甲·丙环唑悬浮剂的防治效果较佳。75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂由戊唑醇和肟菌酯复配而成，肟菌酯主要作用于真菌的线粒体呼吸链中的细胞色素 bcl复合体，阻止电子传递从而抑制真菌生长[17]，戊唑醇作用机理是抑制麦角甾醇中间体的氧化脱甲基反应，从而间接地对甾醇混合物的组成产生影响，导致病原菌不能形成细胞膜而死亡[18]。75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂最高防效为82.88%。10%苯甲·丙环唑悬浮剂由苯醚甲环唑和丙环唑复配而成，苯醚甲环唑是甾醇脱甲基化抑制剂，抑制甾醇的生物合成，阻止真菌生长，丙环唑影响甾醇生物合成，破坏病原菌细胞膜功能，最终导致细胞死亡[19]。10%苯甲·丙环唑悬浮剂最高防效为82.16%，也显著高于单剂430 g·L-1戊唑醇悬浮剂的防效。同时也表明混配不同作用机理的杀菌剂不仅提高了防效，而且使病原菌不易产生抗药性。

铁皮石斛锈病的发生期为2～11月，发病时间较长，其发生发展与当地气候条件、种植园区环境密切相关。高温高湿环境有利于锈病发生，此外锈孢子可借风、雨、昆虫传播，人工喷灌浇水等农事操作也会促进病害发生。铁皮石斛栽培场所应保持种植园区通风，保持环境卫生，经常检查叶片背面，发现病叶及时剪除和清除，减少侵染菌源。合理轮换或混用不同作用机理的杀菌剂，对有效控制病害、减少用药量及减缓病菌抗药性都有重要意义。生产中可交替使用 10%苯甲·丙环唑悬浮剂和 75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂防治铁皮石斛锈病。