基于Notch1/ROR-γt信号通路研究芹菜素对自身免疫性甲状腺炎小鼠的保护作用

李泽垄，李智奇，喻涛

（深圳市龙华区人民医院甲乳外科，广东深圳 518109）

自身免疫性甲状腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）是一种临床上常见的自身免疫功能紊乱所引起的甲状腺疾病[1]。其病因复杂且临床症状多样，有研究报道AIT 的致病机制涉及炎症、凋亡和氧化损伤等[2-3]。AIT 患者的主要临床症状有甲状腺肿大、功能减退以及纤维化等[4]。特别是近年来随着生活方式的逐渐改善以及生活环境的恶化，AIT 的发病率有明显上升的趋势[5]。临床使用抗AIT 药物品种较多，如糖皮质激素、左旋甲状腺素、雷公藤多苷片等。虽然AIT 病患可获得某些症状的改善，但存在药物使用的其他问题不容忽视，如服后不良反应多和断药易复发等[6]。故开发新的替代药物仍是当务之急。

芹菜素，别称为芹黄素或洋芹素，是一种广泛存在于各种水果和蔬菜、豆科植物以及茶叶中的黄酮类化合物，其中在芹菜中的含量最高，已有较多的研究[7]表明芹菜素具有良好的抗炎、抗氧化、免疫调节、抗癌、抗病毒等多种生物活性。基于以上特性，芹菜素是否对自身免疫性甲状腺炎具有良好的保护作用目前尚未见相关研究报道。本实验通过建立小鼠自身免疫性甲状腺炎模型，从炎症、氧化应激和凋亡角度，探讨其对自身免疫性甲状腺炎的影响。

1 材料

1.1 动物

60只SPF的雌性BALB/c小鼠，体质量18～22 g，购于广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCⅩK（粤）2019-0002。

1.2 药品与试剂

芹菜素（质量分数≥98%，陕西慧科植物开发有限公司）；雷公藤多苷片（10 mg/片，贵州汉方药业有限公司）；PTg、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂（Sigma公司）；碘化钠（NaI，金锦乐化学有限公司）；小鼠TPOAb 化学发光试剂盒、小鼠TGAb 化学发光试剂盒（上海安妍生物有限公司）；TNF-α、IL-1βELISA 检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；SOD、MDA 试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；Bcl-2、Bax单克隆抗体（北京博奥生物）。

1.3 主要仪器

800TS 吸收光酶标仪（美国Biotek 伯腾公司）；IⅩ71 光学显微镜（日本Olympus 公司）；JYD-325型轮转切片机（金华市宇典医疗器械厂）；WD-9413C型凝胶成像分析系统（福州申辉化工仪器设备有限公司）。

2 方法

2.1 小鼠自身免疫性甲状腺炎模型构建

参照文献[8]方法构建动物AIT 模型，将PTg 与完全弗氏佐剂按体积比1∶1 制成油包水乳剂，制备质量浓度为0.25 mg/mL的溶液。按50 μg/只的剂量从动物背部皮下选取多个注射点注射上述自制的乳剂，给药1 次/周，给药周期为2 周。从第3 周开始注射由不完全弗氏佐剂联合PTg 乳化的油包水乳剂，制备质量浓度为0.25 mg/mL 的溶液，给药剂量和频次同上，给药周期为3周，每周的注射部位分别为背部皮下、颈部皮下以及腹腔，每日正常自由饮用高碘水，质量浓度为0.63 mg/mL，构建小鼠AIT模型。

2.2 分组与给药

实验分为6 组：空白对照组、模型组、雷公藤多苷片组、芹菜素低、中、高剂量组，每组10 只。造模后灌胃给药，其中雷公藤多苷片组给药剂量为5 mg/（kg·d），芹菜素低、中、高剂量组的给药剂量分别为[15、30、60 mg/（kg·d）]，而空白对照组和模型组给予等量0.9%NaCl 溶液，1 次/d，共14 d。

2.3 检测指标

实验完成后，小鼠摘眼球取血，静置4 ℃冰箱2 h，3 500 r/min 4 ℃冷冻离心5 min，小心分离血清并-80 ℃保存备用。酶联免疫法分别检测血清中TGAb、TPOAb的水平。ELISA酶联免疫法检测TNF-α和IL-1β水平。化学发光法检测血清SOD 活性和MDA 含量。小心分离小鼠甲状腺组织，10%（φ）中性甲醛溶液浸泡固定左侧甲状腺组织，用于石蜡包埋、切片和HE 染色，观察甲状腺病理学变化。Western blot 法检测右侧甲状腺组织匀浆Bcl-2和Bax的蛋白含量。

2.4 统计学方法

利用SPSS 17.0 软件，计量资料以表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠血清TGAb和TPOAb水平

与空白对照组比较，模型组小鼠血清TGAb 和TPOAb水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，雷公藤多苷片组和芹菜素给药组小鼠血清TGAb 和TPOAb水平均明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。与芹菜素低剂量组比较，雷公藤多苷片组和芹菜素高剂量组小鼠血清TGAb 和TPOAb 水平明显降低（P＜0.05），见图1。

图1 各组小鼠血清TGAb和TPOAb水平Figure 1 Levels of TGAb and TPOAb in serum of mice in each group()

3.2 各组小鼠血清SOD活性和MDA含量

与空白对照组比较，模型组小鼠血清SOD 活性明显降低（P＜0.01），MDA 含量明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，雷公藤多苷片组和芹菜素给药组小鼠血清SOD 活性明显升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA含量明显降低（P＜0.01）。与芹菜素低剂量组比较，雷公藤多苷片组和芹菜素高剂量组小鼠血清SOD活性明显升高（P＜0.05），MDA 含量明显降低（P＜0.05）。见图2。

图2 各组小鼠血清SOD活性和MDA含量Figure 2 SOD activity and MDA content in serum of mice in each group()

3.3 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β水平

与空白对照组比较，模型组小鼠血清TNF-α和IL-1β水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，雷公藤多苷片组和芹菜素给药组小鼠血清TNF-α和IL-1β水平均明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。与芹菜素低剂量组比较，雷公藤多苷片组和芹菜素高剂量组小鼠血清TNF-α和IL-1β水平明显降低（P＜0.05）。见图3。

图3 各组小鼠血清TNF-α和IL-1β水平Figure 3 Levels of TNF-α and IL-1β in serum of mice in each group()

3.4 各组小鼠甲状腺组织病理学观察

空白对照组小鼠甲状腺组织中腺泡呈立方状，间质厚度正常，无炎症细胞浸润，腺泡腔内的胶质分布均匀（图4A）。模型组小鼠甲状腺结构异常，滤泡间隔厚薄不一，大量炎症细胞浸润（图4B）。相对模型组，雷公藤多苷片组和芹菜素给药组以上症状有不同程度的改善，可见甲状腺滤泡间隔变薄，炎症细胞浸润减轻，其中芹菜素高剂量组和雷公藤多苷片组改善效果最好（图4C-F）。

图4 各组小鼠甲状腺组织病理学观察（HE染色，200×）Figure 4 Histopathological observation of thyroid tissue of mice in each group(HE staining,200×)

3.5 各组小鼠甲状腺组织Bcl-2、Bax、Notch1 和ROR-γt蛋白的表达水平

与空白对照组比较，模型组小鼠甲状腺组织Bcl-2 蛋白的相对表达量显著降低（P＜0.01），而Bax、Notch1 和ROR-γt 蛋白的相对表达量显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，雷公藤多苷片组和芹菜素给药组小鼠甲状腺组织Bcl-2 蛋白的相对表达量显著升高（P＜0.05，P＜0.01），而Bax、Notch1和RORγt 蛋白的相对表达量显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。与芹菜素低剂量组比较，芹菜中，高剂量组Bax相对表达下降（P＜0.05，P＜0.01）。与芹菜素低剂量组比较，雷公藤多苷片组和芹菜素高剂量组小鼠甲状腺组织Bcl-2 蛋白的相对表达量显著升高（P＜0.05），而Notch1 和ROR-γt 蛋白的相对表达量显著降低（P＜0.05）。见图5。

图5 各组小鼠甲状腺组织Bcl-2、Bax、Notch1和ROR-γt蛋白的表达水平Figure 5 Expression levels of Bcl-2,Bax,Notch1 and ROR-γt in Thyroid tissues of mice in each group()

4 讨论

AIT 是免疫系统功能紊乱、环境以及遗传等多种因素综合作用所引起的一种自身免疫性疾病。近年来研究发现除免疫功能紊乱外，炎症、氧化损伤和凋亡等机制共同参与该病的发生发展。目前，以动物皮下多点注射猪甲状腺球蛋白联合高碘水的方法建立的AIT 动物模型较为常见，该模型不仅能较好地模拟AIT的主要症状，而且操作简单、模型复现性好，受到较多的科研工作者青睐[9]。近年来，随着中医药研究的不断深入，特别在抗AIT药物发掘方面取得了一定的进展。如雷公藤多苷片，其主要用于类风湿性关节炎、肾病综合征和系统性红斑狼疮等多种自身免疫性疾病的治疗，最近研究表明其可能通过抗炎、免疫调节以及抗氧化损伤等作用对AIT 具有良好的疗效[10]。因此，本研究选取雷公藤多苷片作为阳性对照药，比较芹菜素对小鼠AIT模型的作用。

芹菜素是一种广泛存在于各种水果和蔬菜、豆科植物以及茶叶中的黄酮类化合物，其具有良好的抗炎、抗氧化、免疫调节、抗癌、抗病毒等多种生物活性，本研究探讨其对小鼠AIT模型的作用及机制。TGAb 和TPOAb 作为AIT 的两种特征性自身抗体，是临床诊断AIT 的重要指标之一[11]。本研究发现模型组血清TGAb 和TPOAb 水平较空白对照组明显升高，甲状腺损伤严重，可见大量炎症细胞浸润，血清TNF-α和IL-1β水平明显升高，提示小鼠AIT模型构建成功。给予雷公藤多苷片和芹菜素后，小鼠血清TGAb、TPOAb、TNF-α和IL-1β水平明显降低，明显改善甲状腺组织炎症细胞浸润程度，呈现一定的剂量依赖性，其中以雷公藤多苷片组和芹菜素高剂量组效果最优。SOD 和MDA 是现代研究机体氧化应激的重要指标之一。SOD 作为机体重要的抗氧化酶，对自由基具有消除作用，可防御机体的氧化损伤[12]。MDA 作为机体氧化损伤后产物，其水平与机体氧化损伤程度成正比[13]。本研究发现模型组的血清SOD 活性较空白对照组明显降低，而MDA 含量明显升高。给予雷公藤多苷片和芹菜素后血清SOD 活性明显升高，MDA 含量明显降低。其中以雷公藤多苷片组和芹菜素高剂量组效果最优。Bcl-2 是机体内一种重要的凋亡抑制基因，能遏制多种有害因素导致细胞凋亡[14]。相反，Bax 是机体内一种重要的凋亡促进基因，可促进细胞的凋亡[15]。本研究发现模型组小鼠甲状腺组织Bcl-2 蛋白的表达水平较空白对照组明显下调，而Bax 蛋白的表达水平显著上调。给予雷公藤多苷片和芹菜素后，小鼠甲状腺组织Bcl-2 蛋白的表达水平明显上调，Bax 蛋白的表达水平显著下调。其中以雷公藤多苷片组和芹菜素高剂量组效果最优。近年来，研究表明Notch1和ROR-γt除了参与诱导细胞凋亡的作用外，还参与调控机体炎症反应，与自身免疫性疾病的发生发展密切相关[16]。本研究发现芹菜素和雷公藤多苷片可抑制小鼠甲状腺组织Notch1 和ROR-γt 蛋白的表达水平，其中以芹菜素高剂量组和雷公藤多苷片组效果最优。提示芹菜素可能通过Notch1/RORγt信号通路改善自身免疫性疾病的凋亡和炎症。

综上所述，芹菜素可通过降低小鼠AIT 特征性自身抗体TGAb、TPOAb水平，减轻炎症细胞浸润程度和氧化应激损伤，以及抑制细胞凋亡，对AIT具有较好的保护作用。